[發明專利]一種羅伊乳酸桿菌的電轉化方法

在審

• 申請號: 201410514830.6
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104313045A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 李旺;張光勤;李元曉;何萬領;丁軻
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12R1/225
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 羅民健

技術領域

本發明涉及一種乳酸桿菌的轉化方法，具體的說是羅伊乳酸桿菌電轉化重組質粒pLEM415-cel15的方法。

背景技術

羅伊乳酸桿菌（L.?reuteri）是動物的腸道益生菌，可作為微生態制劑廣泛應用于動物飼料中，益生作用主要表現為調節胃腸道微生物區系平衡，提高機體的免疫力和抵抗力，促進機體生長。鑒于乳酸桿菌作為益生菌的廣泛應用及其自身的腸道定植能力，近年來許多研究將乳酸桿菌作為基因工程的宿主細胞進行研究。然而，像其他革蘭氏陽性細菌一樣，乳酸桿菌細胞壁上存在肽聚糖層，細胞壁較厚，不利于電轉化時外源DNA進入胞內，嚴重制約著乳酸桿菌的轉化。隨著眾多電轉儀的研發生產和應用，電擊轉化是一種操作簡單且轉化效率較高的轉基因技術。1984年Harlander和Mckay成功電擊轉化鏈球菌后，研究人員開始探索乳酸菌的電擊轉化條件，并將電擊轉化成功應用于乳酸桿菌、乳酸球菌和其他乳酸菌。電轉化效率的高低具有很高的菌株依賴性，即使同種屬的不同菌株應用同一轉化條件進行轉化，轉化效率也存在很大差異。目前，羅伊乳酸桿菌陽性克隆的得率較低，極大的影響了乳酸桿菌基因工程進展的效率。

發明內容

本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種羅伊乳酸桿菌電轉化的方法，其能將質粒載體pLEM415-cel15高效轉化入羅伊乳酸桿菌，?轉化效率可提高10倍，可提高后期重組質粒的得率以及基因工程操作的成功率。

一種羅伊乳酸桿菌電轉化的方法，包括以下步驟：

步驟一、羅伊乳酸桿菌感受態細胞制備

（1）、在MRS固體培養基劃線復蘇羅伊乳酸桿菌，挑取羅伊乳酸桿菌單菌落接種至5?mL的?MRS液體培養基中，置于37℃下過夜培養，得到種子液；將種子液接種到50的?mL?MRS液體培養基中，接種量為MRS液體培養基體積的10%，然后置于37℃靜置培養，當OD值達到1.0時，取出進行冰浴10?min，然后4℃、6?000?r/min離心15?min，棄上清，收集菌體細胞；

（2）、對所收集的菌體細胞進行洗滌，洗滌方法為：先用10mmol/L的MgCl₂水溶液，再用蔗糖甘油混合溶液洗滌，最后用體積濃度為10%的甘油水溶液洗滌；洗滌結束后加入體積濃度為10%的甘油水溶液，吹打使菌體細胞懸浮，即制備出羅伊乳酸桿菌感受態細胞，分裝，置于-80℃保存，備用；

所述蔗糖甘油混合溶液為，體積比為1:1的0.5?mol/L蔗糖水溶液和體積濃度為10%的甘油水溶液的混合物；??

步驟二、將所制備的羅伊乳酸桿菌感受態細胞從-80℃取出，置于冰上解凍5?min，加入2μL濃度為0.2μg/μL的質粒載體pLEM415-cel15，混勻后將所得混合物轉移至預冷的電擊杯中，冰浴5?min，輕震電擊杯使混合物進入電擊杯底部；然后在電阻200Ω、電容25μF、電壓1.5?kv/mm的條件下，電擊轉化感受態細胞，之后將混合物轉移到1000μL?MRS液體培養基中，置于37℃復蘇培養2?h后，涂布于含紅霉素的MRS固體培養基上培養24-48?h；

步驟三、?從含紅霉素的MRS固體培養基上隨機挑取單菌落，擴大培養后，提取質粒，并做PCR鑒定陽性克隆；同時進行菌落計數，并計算轉化效率。電轉化效率（CFU/μg?DNA）=稀釋倍數×菌落數/質粒DNA質量。

所述MRS液體培養基，每升培養基中含有蛋白胨10.0?g、牛肉膏?10.0?g?、酵母膏?5.0?g?、檸檬酸氫二銨[（NH₄）₂HC₆H5O₇]?2.0?g、?葡萄糖(C₆H₁₂O₆·H₂O)?20.0?g?、1.0?mL吐溫80、乙酸鈉（CH₃COONa·3H₂O）5.0g、磷酸氫二鉀（K₂HPO₄·3H₂O）2.0?g?、硫酸鎂（MgSO₄·7H₂O）?0.58?g?、硫酸錳（MnSO₄·H₂O）0.25?g，余量為水；pH值為6.2-6.6。