[發明專利]一種羅伊乳酸桿菌的電轉化方法

在審

• 申請號: 201410514830.6
• 申請日: 2014-09-30
• 公開（公告）號: CN104313045A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 李旺;張光勤;李元曉;何萬領;丁軻
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12R1/225
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 羅民健

1.一種羅伊乳酸桿菌的電轉化方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一、羅伊乳酸桿菌感受態細胞制備

（1）、在MRS固體培養基劃線復蘇羅伊乳酸桿菌，然后挑取羅伊乳酸桿菌單菌落接種至5?mL的?MRS液體培養基中，置于37℃下過夜培養，得到種子液；將種子液接種到50?mL的MRS液體培養基中，接種量為MRS液體培養基體積的10%，然后置于37℃靜置培養，當OD值達到1.0時，取出冰浴10?min，然后4℃、6000?r/min離心15?min，棄上清，收集菌體細胞；

（2）、洗滌所收集的菌體細胞，洗滌方法為：先用10mmol/L的MgCl₂水溶液洗滌，再用蔗糖甘油混合溶液洗滌，最后用體積濃度為10%的甘油水溶液洗滌；洗滌結束后加入體積濃度為10%的甘油水溶液，吹打使菌體細胞懸浮，即制備出羅伊乳酸桿菌感受態細胞，分裝，置于-80℃保存，備用；

所述蔗糖甘油混合溶液為，體積比為1:1的0.5?mol/L蔗糖水溶液和體積濃度為10%的甘油水溶液的混合物；??

步驟二、將所制備的羅伊乳酸桿菌感受態細胞從-80℃取出，置于冰上解凍5?min，加入2μL濃度為0.2μg/μL的質粒載體pLEM415-cel15，混勻后將所得混合物轉移至預冷的電擊杯中，冰浴5?min，輕震電擊杯使混合物進入電擊杯底部；然后在電阻200Ω、電容25μF、電壓1.5?kv/mm的條件下，電擊轉化感受態細胞，之后將混合物轉移到1000μL?MRS液體培養基中，置于37℃復蘇培養2?h后，涂布于含紅霉素的MRS固體培養基上培養24-48?h。

2.如權利要求1所述的羅伊乳酸桿菌的電轉化方法，其特征在于：所述MRS液體培養基，每升培養基中含有10.0?g?蛋白胨、?10.0?g牛肉膏、?5.0?g酵母膏、2.0?g檸檬酸氫二銨、?20.0?g葡萄糖、1.0?mL吐溫80、5.0g乙酸鈉、2.0?g磷酸氫二鉀、0.58?g硫酸鎂、0.25?g硫酸錳，余量為水；pH值為6.2-6.6。

3.如權利要求1所述的羅伊乳酸桿菌的電轉化方法，其特征在于：所述MRS固體培養基：每升培養基中含有10.0?g?蛋白胨、?10.0?g牛肉膏、?5.0?g酵母膏、2.0?g檸檬酸氫二銨、?20.0?g葡萄糖、1.0?mL吐溫80、5.0g乙酸鈉、2.0?g磷酸氫二鉀、0.58?g硫酸鎂、0.25?g硫酸錳、18.0?g瓊脂，余量為水；pH值為6.2-6.6。