[發(fā)明專利]一種人松弛素H2前體及其制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410511557.1
• 申請日: 2014-09-29
• 公開（公告）號: CN104447982B
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發(fā)明（設計）人: 周曉雷;張世光;鄒衛(wèi)
• 申請（專利權）人: 深圳市辰瑞爾生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/64
• 分類號: C07K14/64;C12N15/16;A61K38/22;A61P9/04;A61P9/10;A61P11/00;A61P13/12
• 代理公司: 蘇州威世朋知識產權代理事務所(普通合伙)32235
• 代理人: 楊林潔

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，尤其涉及一種人松弛素H2前體及其制備方法和應用。本發(fā)明還涉及經由人松弛素H2前體獲得的成熟的人松弛素及其應用。

背景技術

松弛素（Relaxin）做為一種肽類激素，由Frederick Hisaw在研究妊娠期間骨盆帶變化時首次發(fā)現(xiàn)。松弛素最初被認為是一種妊娠相關激素，在孕婦妊娠期前三月，體循環(huán)中的松弛素水平明顯上升，同時伴隨血流動力學和腎血流改變；同時還具有松弛骨盆韌帶，擴張子宮頸，抑制子宮平滑肌自發(fā)收縮，參與妊娠期結締組織的重建等作用。后來研究發(fā)現(xiàn)，在非妊娠期的婦女及男性體內多種組織都有松弛素的表達，并且具有廣泛的生物學作用，包括血管擴張，有抗炎、細胞外基質重塑、血管生成和抗缺血等作用。目前普遍認為松弛素是一種肽類激素，此類肽家族由7種基因編碼，包括松弛素基因RLN1、RLN2和RLN3，及胰島素樣肽基因INSL3、INSL4、INSL5、INSL6。人類RLN2編碼的松弛素H2是其功能產物，有較強全身和腎臟擴張血管、增加心輸出量，減少體循環(huán)阻力、肺毛細血管楔壓以及NT-proBNP，改善腎功能來調節(jié)心血管反應，對抗對心臟泵血功能有害的機體反應等。人體中松弛素H2是以松弛素H2原的狀態(tài)表達，松弛素原蛋白一級結構按B-C-A的順序排列（見圖1），其中C鏈由108個氨基酸殘基組成，松弛素原產生后由組織中的轉化酶將C鏈切除后，形成成熟的松弛素H2。松弛素H2由53個氨基酸組成，其結構特征是有兩個獨立的多肽鏈( A鏈和B鏈) ，其中A鏈由24個氨基酸殘基構成，B鏈29個氨基酸殘基組成；A、B鏈之間有兩對鏈間二硫鍵相連，A 鏈內有一對鏈內二硫鍵。臨床證據(jù)顯示，松弛素有舒張血管增加血管順應性和抗缺血作用；在血壓正常和增高的急性心衰患者，松弛素可以改善呼吸困難及其他臨床結果，安全性可靠。

由于人松弛素有很好的成藥性，具有極高的臨床應用價值，需求量日益增大，因此推動了人松弛素H2制備方法的研究。目前最為常見的制備方法主要有以下兩種：

1、化學合成法：E.Bullesbach 和 C.Schwabe在1991年及2005年報道了RLX的化學合成方法（J.Biol.Chem.1991,266,10754-10761; J.Biol.Chem.2005,280,14586-14590），松弛素H2的A鏈采用Fmoc法合成，B鏈采用Boc法合成，合成過程需要采用氟化氫處理兩次，并且需要三步進行肽鏈A和肽鏈B的組合，三對二硫鍵采用不同的保護基和不同的脫保護劑。此制備工藝極其復雜，并且產率僅為1.4％，工藝中要求使用高毒性和危險的氟化氫，不適合規(guī)模化生產。

專利US-A-4835251中通過在pH 7至12的氧化條件下將還原游離-半胱氨酸形式的A鏈和還原游離-半胱氨酸形式的B肽鏈在水性介質中混合以產生具有生物活性的人松弛素H2。但由于B肽鏈的水溶性極差，很難在A肽鏈和B肽鏈間形成正確的鏈間二硫鍵。

Barlos KK等（J Pept Sci. 2010 Apr;16(4):200-11）在2010年報道了采用Fmoc法合成肽鏈A和肽鏈B，半胱氨酸的側鏈采用同一保護基，二硫鍵采用隨機組合法形成。但此方法依然無法有效提高松弛素2的產率，產率僅為48%。且肽鏈B的合成工藝復雜，不利于工業(yè)化生產。

專利 CN 102180964 A公開了將肽鏈A和肽鏈B鏈接制備松弛素-2固相合成方法。但因鏈間二硫鍵經常錯配而造成產率較低，并且需多次純化，工藝依然較復雜，不利于工業(yè)化生產。

2、基因工程法