[發明專利]一種甲氧芐啶半抗原化合物T1制備完全抗原的方法和應用

無效

• 申請號: 201410510867.1
• 申請日: 2014-09-29
• 公開（公告）號: CN104370829A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 匡華;徐乃豐;胥傳來;徐麗廣;馬偉;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07D239/49
• 分類號: C07D239/49;C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K1/107;C07K16/44;G01N33/543
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種甲氧芐啶半抗原化合物T1制備完全抗原的方法和應用，屬于生物化工技術領域。

背景技術

三甲氧芐胺嘧啶（Trimethoprim，TMP），又名甲氧芐啶，和二甲氧芐胺嘧啶（Diaveridine，DVD）都是一種二氨基嘧啶類的二氫葉酸還原酶抑制劑，白色結晶型粉末，不溶于水，微溶于氯仿、乙醇、丙酮，但易溶于冰乙酸等有機酸。本身抗菌能力較弱，因此常不單獨使用，但與磺胺類、呋喃類、喹諾酮類等抗生素聯合使用，可大幅度增強抗生素的應用效果，可治療雞白痢、禽霍亂、細菌性感染等畜禽疾病。但抗生素和協同增效劑的過度使用和不合理用藥，使藥物過量殘留于動物性食物中，從而對人體健康造成危害。我國農業部和歐盟、日本等都對TMP?在動物組織中的最大殘留限量值（MRL）做出了規定，其中我國規定?TMP?的標志性殘留物是其本身，其在畜禽肌肉、肝腎、脂肪以及魚肉、皮等組織中的MRL值為?50μg/kg，歐盟明確規定其不能用于蛋類，日本規定其在魚類、雞組織中的?MRL?值為?50μg/kg。?

TMP和DVD的結構式如下：

目前我國對TMP的檢測方法主要有氣相色譜法（LC）、高效液相色譜法(HPLC)、液質聯用法（LC/MS）、酶聯免疫吸附法(ELISA)、膠體金試紙條法等，并且主要集中在HPLC和LC/MS等儀器分析方法上。盡管儀器方法是TMP檢測的確證方法，但存在樣品制備復雜、操作繁瑣、對操作人員素質要求較高、樣本前處理時間太長等缺點，導致檢測成本高，周期長，無法滿足大批量樣本的快速篩查及現場快速檢測的要求。ELISA和膠體金試紙條法屬于免疫分析技術，具有較高的靈敏度和特異性，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測。

免疫分析方法的關鍵在于合適的特異性抗原和抗體的獲得。由于存在活性氨基基團，傳統的TMP人工抗原的合成一般通過EDC法、重氮化法直接與TMP分子上的氨基偶聯，再偶聯載體蛋白。但由于TMP上有不止一個氨基，都能參與反應，因此得到的偶聯物是一個混合物，最終通過免疫動物得到的抗體是針對這種混合物的，抗體的特異性和靈敏度會受到很大影響。而且，由于TMP結構中氨基與嘧啶核直接相連，空間位阻顯著將導致免疫效果較差，所制備的抗體靈敏度不理想。

本發明的甲氧芐啶半抗原是利用嘧啶核一端的氨基衍生出活性羧基，經過純化得到單一特異性結構的甲氧芐啶羧基衍生物（TMP-HS），該衍生物為甲氧芐啶半抗原，將甲氧芐啶半抗原與載體蛋白偶聯最后形成甲氧芐啶完全抗原。

發明內容

本發明的目的是針對現有甲氧芐啶檢測技術及抗原合成、相應抗體制備的不足和缺陷，提供一種甲氧芐啶半抗原化合物T1制備甲氧芐啶完全抗原的方法和應用。

本發明的技術方案，一種甲氧芐啶半抗原化合物T1的制備方法，

甲氧芐啶半抗原化合物T1結構簡式如下：

制備步驟為：在100mL的三頸瓶中依次加入?10mL吡啶、2g丁二酸酐、5mg?4-二甲氨基吡啶，60℃水浴加熱磁力攪拌至溶液澄清；以?10mL?吡啶溶解2.9g甲氧芐啶并滴加到所述三頸瓶中，繼續攪拌反應3天；采用薄層色譜法，以甲醇︰三氯甲烷體積比為1︰5作為展開劑監控反應進程；減壓0.090MPa、50℃蒸餾10min將溶劑全部蒸走，得到淡黃色油狀物；繼續滴加質量體積比為10%的NaHCO₃水溶液至不再產生渾濁，過濾并調節上清液在pH5.0酸性條件下重結晶析出白色固體，6000?r/min離心10min，濾餅50℃烘干即得產品甲氧芐啶半抗原化合物T1。

用所述甲氧芐啶半抗原化合物T1制備甲氧芐啶完全抗原的方法，將甲氧芐啶半抗原化合物T1與載體蛋白偶聯后制備得到甲氧芐啶完全抗原。

所述載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA、匙孔血藍蛋白KLH、血藍蛋白LPH或人血清白蛋白HAS中的一種。

當載體蛋白為BSA時，具體步驟為：

（1）甲氧芐啶半抗原化合物T1的活化：將甲氧芐啶半抗原化合物T1用DMF溶解，按甲氧芐啶半抗原化合物T1︰三正丁胺︰氯甲酸異丁酯的摩爾比為1︰1.2︰1.2比例添加反應物，0℃反應1h，得到活化的甲氧芐啶半抗原化合物T1溶液；