[發明專利]一種基于金核-銀衛星手性組裝體的赭曲霉毒素A的超靈敏檢測方法

有效

• 申請號: 201410510264.1
• 申請日: 2014-09-29
• 公開（公告）號: CN104237136A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 徐麗廣;趙雪利;胥傳來;匡華;馬偉;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N21/19
• 分類號: G01N21/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種基于金核-銀衛星手性結構組裝的赭曲霉毒素A的超靈敏檢測方法，屬于分析化學領域。

背景技術

赭曲霉毒素A由疣孢青霉菌株、產紫青霉菌、圓弧青霉菌株產生，在霉變谷物、飼料等最常見。動物攝入霉變的飼料后，肉制品中就可能含這種毒素。赭曲霉毒素A主要對動物肝臟與腎臟有很強的毒害作用，可以引起腎臟損傷。大量的毒素也可能引起動物的腸黏膜炎癥和壞死。動物試驗中觀察到它還存在致畸作用。

傳統的赭曲霉毒素A（OTA）的檢測方法主要基于儀器，如液質聯用、高效液相色譜等，檢測成本很高，并且對操作人員的操作技能有很高的要求。酶聯免疫檢測則對單克隆抗體的要求很高，而單抗的制備和篩選是一項繁重且高耗的任務。電化學和熒光等新型檢測方法也逐漸被人們開發出來。電化學對樣品的基質要求較高，而熒光檢測需要昂貴的熒光素來制備熒光探針。所以，本發明提出了一種新型的、簡便的、靈敏的檢測方法，其基于納米材料的自組裝技術構建了具有強手性的金核銀衛星納米結構，并以此作為檢測基底。

通過DNA雜交將大粒徑的金納米粒子和小粒徑的銀納米粒子組裝成具有強手性的核衛星結構。目標物和適配體部分互補序列（OTA-C）修飾的銀納米粒子與適配體（OTA-aptamer）修飾的金納米粒子競爭結合，目標物濃度越大，核衛星結構組裝的越不完全，手性信號越弱。將手性信號與目標物的濃度建立標準曲線，以此來定量檢測赭曲霉毒素A。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于金核-銀衛星手性組裝體的赭曲霉毒素A的超靈敏檢測方法。

本發明的技術方案：一種基于金核-銀衛星手性組裝體的赭曲霉毒素A的檢測方法：

（一）檢測傳感器的構建

（1）35?nm?粒徑的金納米粒子的合成

35?nm?粒徑的金納米粒子采用種子生長法合成。

13?nm的金種子采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法合成：反應用的錐形瓶提前用新配制的王水浸泡24h，用超純水沖洗至潔凈，37℃烘干待用。2mL?10mM的氯金酸、38mL超純水加入潔凈的錐形瓶內，加熱至沸騰，加入2mL?38.8mM的檸檬酸三鈉，煮沸20min得到13nm粒徑的金種子。

35nm粒徑金納米粒子的合成：錐形瓶中加入2mL?10mM的氯金酸、0.1mL?10mM的硝酸銀、42.5mL超純水、2mL上述13nm粒徑的金種子，在攪拌狀態下加7.5mL?5.3mM的抗壞血酸溶液以30mL/h的速度泵入，得到直徑35nm的金納米粒子。

（2）8?nm?粒徑的銀納米粒子的合成

錐形瓶的處理同上。錐形瓶中加入超純水20mL、1%PVP?5mL、0.1M硼氫化鈉（新配）0.6?mL，冰浴攪拌狀態下以30mL/h的速度泵入5mL?1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，5mL?1M的硝酸銀溶液，反應后的溶液80℃水浴老化3h，冷卻后放4℃冰箱待用。

（3）金納米粒子上適配體(OTA-aptamer)的修飾

35?nm?粒徑的金納米粒子離心濃縮10倍后用10mM?pH7.2的磷酸鹽緩沖液重懸，加入巰基化的OTA-aptamer使得終濃度為5μM。DNA與金納米粒子的摩爾比為300︰1。室溫孵育2h后加NaCl至50mM，之后每隔1h加一次NaCl，至NaCl終濃度300mM。溶液老化24h后離心3次去除未結合的DNA，10mM?Tris-HCl重懸待用；

OTA-aptamer:?5’-SH-TTTTTTTTTT?GATCGGGTGT?GGGTGGCGTA?AAGGGAGCAT?CGG-3’；

（4）銀納米粒子上適配體部分互補序列(OTA-C)的修飾

采用硼氫化鈉還原硝酸銀的方法合成粒徑為8nm的銀納米粒子；銀納米粒子離心濃縮10倍用10mM?pH8的Tris-HCl重懸，加入OTA的巰基化部分互補序列OTA-C使得終濃度為0.5μM，室溫孵育過夜；OTA-C與銀納米粒子的摩爾比為5︰1；離心去除未結合的DNA，用Tris-HCl重懸待用。

OTA-C:?5’-SH-?TTTTTTTTTT?CCGATGCTCC?CT-3’；

（5）金核-銀衛星結構的組裝

30μL?OTA-aptamer適配體修飾的金納米粒子與150μL?OTA-C適配體部分互補序列修飾的銀納米粒子混合，室溫孵育8h，得金核-銀衛星結構的組裝體混合液；

（二）圓二色譜檢測，建立金銀手性信號疊加與赭曲霉毒素A的濃度的標準曲線