[發明專利]一種鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒、檢測方法及應用

有效

• 申請號: 201410510086.2
• 申請日: 2014-09-28
• 公開（公告）號: CN104232797A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 馮翔;石建芳;高忠翔;唐利軍;黎炎梅;郟志明
• 申請（專利權）人: 武漢科隆生物醫學有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N33/569;C12R1/93
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種鼠肝炎病毒復合型檢測試劑盒和檢測方法。

背景技術

鼠肝炎病毒(mouse?hepatitis?virus，MHV，學術上又稱為Murinecoronavirus)屬冠狀病毒科，是一種核糖核酸(RNA)正向病毒，核酸由單股RNA構成，其大小因動物來源不同有些差別，一般直徑約為80nm-160nm，有很多毒株型。根據鼠肝炎病毒嗜組織特性的不同，可將其分為呼吸株和嗜腸株兩型。呼吸株病毒在易感動物的鼻腔上皮細胞內復制后，可向多種靶器官擴散，常見型病毒包括MHV-1、MHV-3、MHV-JHM、MHV-S和MHV-A59等。嗜腸株病毒選擇性地感染小腸黏膜，極少擴散到其他組織，此型病毒包括MHV-Y、MHV-RI和DVIM等(殷震等，1997；A.W.Gledhill?et?al,2006；Homberger?FR?et?al,1997；Norio?Hirano?et?al,2013；Casebolt?D?B?et?al,1997)。鼠肝炎病毒包裹著由核衣殼蛋白N與單鏈基因組RNA復合體組成的核衣殼，膜上結合著三種結構糖蛋白，分別為刺突蛋白S、膜蛋白M和小分子外膜蛋白E。在嗜神經毒株MHV-JHM的被膜上還有血凝素酯酶HE。鼠肝炎病毒侵入宿主后，可以刺激機體產生抗體。

鼠肝炎病毒具有傳染性強、傳播途徑復雜、感染過程多樣化、流行面廣泛、不易發現等特點。鼠肝炎病毒極易感染小鼠，嚴重鼠肝炎病毒感染可在數周之內摧毀小鼠群，并可能需要數年才能恢復。據在1982年血清流行病學調查，我國小鼠群中鼠肝炎的感染率為20％-100％(孫靖，2004)。

鼠肝炎病毒可以通過空氣和直接接觸傳播，已感染鼠肝炎病毒鼠的排泄物和其污染的物品很容易感染健康鼠。鼠肝炎病毒也可垂直傳播。小鼠一旦感染后，很難在種群中根除，因此鼠肝炎病毒的檢測非常重要。目前，小鼠肝炎病毒呈世界性分布，在中國的小鼠群中廣泛流行。通常情況下，鼠肝炎病毒感染小鼠后，多數帶病毒小鼠呈隱性、亞臨床或慢性感染，不易察覺，為鼠肝炎病毒的檢測增加了難度。

由于鼠肝炎病毒侵入實驗類鼠群后，會改變各種免疫應答參數，嚴重影響實驗小鼠的質量和科學研究的準確性，不利于科學研究的開展。并且鼠肝炎病毒具有傳染性強、傳播途徑復雜、感染過程多樣化、流行面廣泛、不易發現、危害嚴重等特點，因此快速、高效和方便的鼠肝炎檢測病毒發法尤其重要。

目前，檢測鼠肝炎病毒感染的依賴于血清學測定法，病理組織學，電子顯微鏡以及分子技術。目前市場上常用血清學檢測方法有酶聯免疫吸附試驗和間接免疫熒光試驗等，由于各株抗原的差異，雖實踐中使用了多價抗原檢測法，但依然對不同亞型的鼠肝炎病毒不能統一檢測，仍需用不同的檢測試劑，這樣不僅花費大、耗時長，而且嚴重影響科學研究的正常進行。另外，近年來市場上使用的鼠肝炎病毒核酸檢測盒，其主要方法是通過病毒核酸的反轉錄聚合酶鏈式反應來檢測病毒類型的存在，該類檢測盒雖可以在樣本量很少的情況下進行鼠肝炎病毒檢測，但因病毒核酸變異快，亞類型多，檢測盒僅能檢測部分病毒類型，由于反轉錄聚合酶鏈式反應所需探針的序列、敏感性及熱循環程度等不同導致結果不同，導致檢測陽性率低和假陽性的存在，所得結果仍需要相互確證。因此，有必要在本領域中建立快速，有效和可靠的監測和檢測鼠肝炎病毒的方法。不僅對提高實驗動物質量具有重要意義，同時對于新型冠狀病毒的研究也會有一定的幫助。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的缺陷，提供一種克服單一的聚合酶鏈式反應(PCR)方法所存在的不能統一檢測和假陽性率較高等問題，具有高度的特異性、靈敏性與準確性，且技術操作簡便的鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒，該試劑盒含有：

(1)一步法反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)試劑，其中包括無核糖核酸酶去離子水、焦磷酸核苷酸混合物、五倍反應緩沖液、酶混合液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、陽性對照品、陰性對照品、鼠肝炎病毒探針Ⅰ、探針Ⅱ、探針Ⅲ；

鼠肝炎病毒探針Ⅰ如序列表中的SEQ?ID?NO.1所示：5′-GAGGATTACCATACACTAAC-3′；

鼠肝炎病毒探針Ⅱ如序列表中的SEQ?ID?NO.2所示：5′-AAGGTAGACGGTGTTAGCGG-3′；

鼠肝炎病毒探針Ⅲ如序列表中的SEQ?ID?NO.3所示：5′-TTTAACCCGCGCTCGGTTTG-3′；