[發明專利]一種鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒、檢測方法及應用

有效

• 申請號: 201410510086.2
• 申請日: 2014-09-28
• 公開（公告）號: CN104232797A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 馮翔;石建芳;高忠翔;唐利軍;黎炎梅;郟志明
• 申請（專利權）人: 武漢科隆生物醫學有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N33/569;C12R1/93
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

1.一種鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有：?

(1)一步法反轉錄聚合酶鏈式反應試劑，其中包括焦磷酸核苷酸混合物、五倍反應緩沖液、鼠肝炎病毒探針、無核糖核酸酶去離子水、酶混合液、磷酸鹽緩沖液、陽性對照品和陰性對照品，所述鼠肝炎病毒探針包括鼠肝炎病毒探針Ⅰ、鼠肝炎病毒探針Ⅱ、鼠肝炎病毒探針Ⅲ；?

鼠肝炎病毒探針Ⅰ如序列表中的SEQ?ID?NO.1所示：5′-GAGGATTACCATACACTAAC-3′；?

鼠肝炎病毒探針Ⅱ如序列表中的SEQ?ID?NO.2所示：5′-AAGGTAGACGGTGTTAGCGG-3′；?

鼠肝炎病毒探針Ⅲ如序列表中的SEQ?ID?NO.3所示：5′-TTTAACCCGCGCTCGGTTTG-3′；?

(2)應用S2抗體的快速間接酶聯免疫吸附技術檢測試劑，其中包括應用S2抗體檢測的陽性對照、應用S2抗體檢測的陰性對照、S2抗體；?

應用S2抗體檢測的陽性對照為經試驗檢測含有鼠肝炎病毒抗原蛋白S2的稀釋液；?

應用S2抗體檢測的陰性對照為經試驗檢測不含鼠肝炎病毒抗原蛋白S2的稀釋液；?

S2抗體為抗原蛋白S2通過噬菌體抗體庫篩選后生產獲得的單克隆抗體；?

(3)應用抗原蛋白S2的快速雙抗體夾心酶聯免疫吸附技術檢測試劑，其中包括應用抗原蛋白S2檢測的陽性對照、應用抗原S2檢測的陰性對照、S2蛋白稀釋液；?

應用抗原蛋白S2檢測的陽性對照為經試驗檢測含有鼠肝炎病毒S2抗體的稀釋液；?

應用抗原蛋白S2檢測的陰性對照為經試驗檢測不含鼠肝炎病毒S2抗體的稀釋液；?

S2蛋白稀釋液為溶于磷酸鹽緩沖液中的S2抗原蛋白；?

(4)包被液；?

(5)洗滌液，包括洗滌液Ⅰ和洗滌液Ⅱ；?

(6)封閉液；?

(7)辣根過氧化物酶-蛋白A偶聯物；?

(8)酶反應底物；?

(9)終止液；?

(10)脫氧核糖核酸酶Ⅰ；?

(11)肝素。?

2.根據權利要求1所述的鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒，其特征在于，所述鼠肝炎病毒探針選自鼠肝炎病毒核酸的共同恒定區序列。?

3.根據權利要求1所述的鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒，其特征在于，所述酶混合液含有莫洛尼氏鼠白血病毒反轉錄酶和脫氧核糖核酸聚合酶。?

4.根據權利要求1所述的鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品為含有鼠肝炎病毒核酸的樣品稀釋液；所述陰性對照品為不含有鼠肝炎病毒核酸的樣品稀釋液。?

5.根據權利要求1所述的鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒，其特征在于，所述S2蛋白基因序列選自鼠肝炎病毒目前流行的6種主要亞型的共同特有的結構蛋白S穩定區S2基因區域，并通過基因工程技術生物合成S2蛋白；所述6種主要亞型為MHV-1、MHV-2、MHV-3、JHM、A59和S。?

6.根據權利要求1所述的鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒，其特征在于，所述S2抗體通過噬菌體抗體庫篩選技術和酶聯免疫吸附技術制備。?

7.根據權利要求1所述的鼠肝炎病毒的復合型檢測試劑盒，其特征在于，所述辣根過氧化物酶-蛋白A偶聯物直接用于特異性抗體檢測；所述辣根過氧化物酶-蛋白A偶聯物由以下步驟制備：?

(1)溶解2毫克過氧化物酶于500μl去離子水中；?

(2)加入100μl新鮮制備的0.1M高碘酸鈉，室溫下避光攪拌20min；?

(3)將上述修飾后的酶化合物在1升1.0mM醋酸鈉緩沖液中于4℃隔夜透析；?

(4)溶解2毫克蛋白A在500μl?10mM碳酸鈉緩沖液，溶液pH為9.5；?

(5)通過加入250μl?pH為9.5的0.2M的碳酸鈉緩沖液調整透析后酶溶液pH為9.0-9.5，在室溫下攪拌該混合物3小時；?

(6)加入50μl新鮮配制的4mg/ml硼氫化鈉溶液，混勻后，4℃攪拌?2-3小時；?

(7)在1L磷酸鹽緩沖液中透析上述溶液，透析6-16小時后更換新的磷酸鹽緩沖液透析液繼續透析6-16小時；?

(8)按照每1ml上述溶液加入5mg牛血清蛋白的比例添加牛血清蛋白，將溶液儲存于-20℃；?