[發(fā)明專利]一種環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣無漿體病原的試劑中的用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410509621.2
• 申請日: 2014-09-18
• 公開（公告）號: CN104293936A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設計）人: 倪宏波;王欣;王云光;安先全;蔣慧婷
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及一種環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣無漿體病原的試劑中的用途。

背景技術

牛邊緣無漿體病是一種由邊緣無漿體經(jīng)蜱傳播的專性寄生于紅細胞內的血液傳染疾病，主要引起牛、羊等反芻動物發(fā)病，。其特征為高熱、貧血、消瘦、黃疸和膽囊腫大并廣泛分布于世界熱帶和亞熱帶地區(qū)引起奶牛和肉牛產(chǎn)業(yè)相當大的經(jīng)濟損失(Katherine?et?al.，2010)。檢測牛邊緣無漿體的常見基因包括16S?rRNA，熱休克蛋白(groEL基因)(Lew?et?al.，2003)，主要表面蛋白-1a(Msp1a)(Lew?et?al.，2002；Molad?et?al.，2004)，Msp4(Molad?et?al.，2004)和Msp5(Molad?et?al.，2004；Corona?et?al.，2009)。牛邊緣無漿體主要表面蛋白Msp5是由633bp單拷貝基因編碼高度保守的19ku的蛋白，在免疫印跡試驗中通過與單克隆抗體表面蛋白結合，Msp5?ANAF16C1證明在已知的無漿體屬的幾個亞種中是高度保守的(Visser?et?al.，1992；et?al.，2012)。因此，Msp5可以作為一種有效的診斷抗原。傳統(tǒng)的檢測邊緣無漿體Msp5基因的方法是競爭性酶聯(lián)免疫吸附法(CELISA)(Strik?et?al.，2007；Echaide?et?al.，1998)競爭抑制性酶聯(lián)免疫吸附法(CI-ELISA)(NI?et?al.，2011)，間接熒光抗體試驗(IFAT)(OIE，2009)，套式PCR法(Echaide?et?al.，1998)，實時熒光定量PCR(Picoloto?et?al.，2010)和半套式PCR測定法(Singh?et?al.，2012)。但是這些方法還有許多缺陷，例如，它們必須在實驗室進行并且反應需要很長的時間。自2000年以來，Notomi開發(fā)出了環(huán)介導等溫擴增方法(LAMP)，在恒溫條件(60℃-65℃)下，不到1h的時間里進行核酸擴增，具有特異性強、等溫靈敏、操作簡單、產(chǎn)物易檢測等優(yōu)點。環(huán)介導等溫擴增技術已經(jīng)廣泛應用于快速檢測動物病原(病毒、細菌、寄生蟲)(Tomita?et?al.，2008)。然而，使用LAMP技術診斷牛邊緣無漿體病尚未見報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷，提供一種環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣無漿體病原的試劑中的用途，根據(jù)牛邊緣無漿體保守基因Msp5設計了引物，評估LAMP技術的檢測方法。

其具體技術方案為：

一種環(huán)介導等溫擴增引物在制備檢測牛邊緣無漿體病原的試劑中的用途，

特異性LAMP引物根據(jù)Msp5基因設計3對引物：外，內，環(huán)引物，正向外引物命名為Msp5-F3b，反向外引物命名為Msp5-B3b，正向內引物命名為Msp5-FIPb，反向內引物命名為Msp5-BIPb，為了加速反應設計環(huán)路引物，其中包括正向環(huán)引物Msp5-LFb和反向環(huán)引物Msp5-LBb，三對的外引物用于PCR檢測；

優(yōu)選地，采用以下步驟完成：

LAMP反應體系是25μL，包括0.4μM外引物(Msp5-F3和Msp5-B3)，1.6μM內引物(Msp5-FIP和Msp5-BIP)，0.8μM環(huán)引物(Msp5-LF和Msp5-LB)，1μLDNA樣品，硫酸鎂1mM?dNTP?Mix1mM(TAKARA?BIO?INC.，Japan)，1mM甜菜堿(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，2.5μL10×Thermopol?buffer(New?England?Biolabs，Inc.，MA)1U的Bst?DNA聚合酶(New?England?Biolabs，Inc.，MA)，加ddH₂O共25μL。混勻后，加入20μL油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)混勻并離心。在PCR管的中下部加入0.5μL?SYBR?GREEN?I染料(Sigma-Aldrich?St.Louis，MO)然后輕輕蓋上，以防止SYBR?GREEN?I染料降入管底。將混合物在63℃下恒溫反應20分鐘。反應后，在光亮視野下觀察到混合物與SYBR?GREEN?I染料在PCR管中的顏色變化，并在紫外線照射下365nm處也可觀察到。之后LAMP產(chǎn)物(3μL)用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：