[發(fā)明專利]trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定南湖菱中的應(yīng)用及鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410509124.2
• 申請(qǐng)日: 2014-09-28
• 公開（公告）號(hào): CN104293935A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李軍;李白;高廣春;黃嬛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（所）
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定南湖菱中的應(yīng)用及鑒定方法。

背景技術(shù)

南湖菱(Trapa?acornis?Nakano)為菱科菱屬植物，又名無角菱、和尚菱等，因主產(chǎn)浙江嘉興南湖而得名，是我國(guó)特產(chǎn)的水生經(jīng)濟(jì)作物，2009年獲得國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品稱號(hào)。南湖菱果實(shí)無角、殼薄，富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和抗癌活性成分，具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。

目前，尚無關(guān)于南湖菱分子鑒定的文獻(xiàn)報(bào)道。關(guān)于菱屬植物的分類學(xué)研究多集中在常規(guī)的形態(tài)分類學(xué)以及數(shù)量分類學(xué)、細(xì)胞分類學(xué)、花粉形態(tài)學(xué)等方面，對(duì)菱各品種的聚類分析存在一定差異。由于菱的株葉形態(tài)及去除菱殼后的果肉等營(yíng)養(yǎng)形態(tài)基本相同，依靠傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)方法在南湖菱的鑒別上存在局限性。近年來已有應(yīng)用分子生物學(xué)方法研究菱屬植物親緣關(guān)系及分子鑒別的研究報(bào)道，研究結(jié)果多集中在應(yīng)用DNA指紋標(biāo)記對(duì)菱屬植物進(jìn)行分類及系統(tǒng)進(jìn)化方面。鑒于菱在農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域的重要作用，針對(duì)其種質(zhì)混亂及鑒別方法的不統(tǒng)一性，對(duì)單一品種菱建立一套可靠的分子鑒別方法勢(shì)在必行。

DNA條形碼(DNA?barcoding)技術(shù)是利用標(biāo)準(zhǔn)的、具有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段在物種內(nèi)的特異性和物種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識(shí)別系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速自動(dòng)鑒定。DNA條形碼技術(shù)研究中常用的DNA序列有marK、trnH-psbA、rbcL和ITS等。該技術(shù)已被成功應(yīng)用于生物物種分類和鑒定等領(lǐng)域，并成為進(jìn)展最迅速的學(xué)科前沿之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)南湖菱的trnH-psbA序列的278bp和308bp堿基與其它品種存在差異，基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定南湖菱中的應(yīng)用。

trnH-psbA序列作為DNA條形碼在鑒定南湖菱中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了trnH-psbA序列作為DNA條形碼在制備鑒定南湖菱試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種鑒定南湖菱的方法，包括以下步驟：

利用PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品的trnH-psbA序列并進(jìn)行測(cè)序，如果trnH-psbA序列的278bp堿基為A、308bp堿基為T，則判定待測(cè)樣品為南湖菱。

鑒定范圍為菱角，可以包括浙江嘉興南湖菱、浙江溫州二角菱、江蘇南京二角菱、浙江嘉興四角紅菱及江蘇南京四角菱。

南湖菱中所述trnH-psbA序列的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示，278bp堿基為A，308bp堿基為T，如序列滿足該條件，說明樣品為南湖菱。

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

10×PCRbuffer，2μL；dNTP?mixture，0.5μL；10μM上游引物，0.5μL；10μM下游引物，0.5μL；樣品DNA1μL；Taq?DNA聚合酶，0.2μL；補(bǔ)充無菌水至20μL。

所述PCR擴(kuò)增的引物對(duì)為：

上游引物：5’-TCCGCCCCTTACTTTCTTCC-3’

下游引物：5’-CGTAATGCTCACAACTTCCCT-3’。

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：

94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保溫5min。

本發(fā)明還提供了一種鑒定南湖菱的DNA條形碼，堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。

與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法和DNA指紋標(biāo)記相比，本發(fā)明利用trnH-psbA序列作為DNA條形碼鑒定南湖菱，可通過對(duì)trnH-psbA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，直接獲得鑒定結(jié)果，檢測(cè)準(zhǔn)確性高、可重復(fù)性高，鑒定時(shí)間短。

附圖說明

圖1是南湖菱果實(shí)照片。

圖2是本發(fā)明的南湖菱及其他品種菱trnH-psbA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖，其中，泳道1～5分別為：浙江嘉興南湖菱(T1-1)、浙江溫州二角菱(T2-1)、江蘇南京二角菱(T2-2)、浙江嘉興四角紅菱(T3-1)、江蘇南京四角菱(T3-2)，M為DL2000plus?DNAmarker。

圖3是南湖菱及其他品種菱trnH-psbA序列的比對(duì)，黑色箭頭分別標(biāo)注南湖菱trnH-psbA序列的序列特異位點(diǎn)，第278bp堿基為“A”、308bp堿基為“T”。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。