[發(fā)明專利]加強(qiáng)了基因簇表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及其構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410506760.X
• 申請(qǐng)日: 2014-09-28
• 公開（公告）號(hào): CN104312967A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬正;俞曉平;徐顯皓;陶立彬;申屠旭萍;邊亞琳;郝培應(yīng);許益鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/76;C12P19/40;C12R1/525
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過(guò)加強(qiáng)基因簇toy?AM在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的表達(dá)提高豐加霉素產(chǎn)量，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豐加霉素是一種新型核苷類抗生素，分子式為C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C₁連接類似鳥嘌呤的脫氮雜嘌呤環(huán)，核心結(jié)構(gòu)為吡咯嘧啶核苷類似物。作用機(jī)理主要是通過(guò)抑制微生物的轉(zhuǎn)錄而影響菌體的生長(zhǎng)，其生物活性研究報(bào)道主要集中在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近期有研究發(fā)現(xiàn)豐加霉素對(duì)多種植物疫病具有良好的防治效果，長(zhǎng)期使用不會(huì)造成環(huán)境污染，而且對(duì)植物生長(zhǎng)也具有一定的調(diào)節(jié)作用。因此，豐加霉素在農(nóng)業(yè)植物病害防治領(lǐng)域具有的應(yīng)用潛力。相對(duì)于化學(xué)合成法，生物法合成豐加霉素以可再生資源為原料，具有反應(yīng)條件溫和、污染少以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此，生物合成法是目前豐加霉素工業(yè)化生產(chǎn)比較經(jīng)濟(jì)有效的方法。

豐加霉素屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，合成途徑復(fù)雜，受到多種因素的限制與調(diào)控，導(dǎo)致豐加霉素合成水平較低，難以規(guī)模化生產(chǎn)。解決該問(wèn)題的現(xiàn)有辦法一般都是通過(guò)傳統(tǒng)的誘變育種作為主要手段篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生產(chǎn)菌株，但篩選到高效菌株的不確定因素多、周期長(zhǎng)。

如何利用分子生物學(xué)等先進(jìn)的技術(shù)手段改良微生物進(jìn)一步提高豐加霉素的產(chǎn)量成為一條可行的思路。McCarty等人以一株合成豐加霉素菌株Streptomyces?rimosus?(ATCC14673)為起始研究對(duì)象，克隆了生物合成豐加霉素基因簇，闡明了豐加霉素的合成過(guò)程及調(diào)控機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)豐加霉素由GTP為前體，經(jīng)多步反應(yīng)合成豐加霉素，其中由toyAM基因負(fù)責(zé)豐加霉素的生物合成，且成簇排列（基因簇）。本研究小組在前期的研究中以具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的豐加霉素生產(chǎn)菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes)?1628為研究對(duì)象，克隆了基因簇中的部分結(jié)構(gòu)基因，如toyB、toyF等，并嘗試在S.?diastatochromogenes?1628中過(guò)量表達(dá)，同時(shí)也克隆了S.?diastatochromogenes?1628中負(fù)責(zé)次級(jí)代謝的多效調(diào)控因子adpA，但是豐加霉素產(chǎn)量提高的幅度只有20%—30%，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)來(lái)說(shuō)仍有待提高。利用代謝工程技術(shù)增加原始菌株生物合成豐加霉素基因簇而不是單個(gè)結(jié)構(gòu)基因的拷貝數(shù)，從而增加豐加霉素合成的代謝通量而提高豐加霉素產(chǎn)量因?yàn)樯婕皢?wèn)題復(fù)雜而未見相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種加強(qiáng)基因簇toyAM表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及構(gòu)建方法與用途。

淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes)?1628是一株拮抗放線菌，其發(fā)酵液對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，經(jīng)分離提取，確定其主要有效成分為豐加霉素，尚未見通過(guò)增加淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌豐加霉素生物合成基因簇的拷貝數(shù)來(lái)提高豐加霉素產(chǎn)量的研究報(bào)道。

本發(fā)明首先從以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes)1628?(菌株的保藏編號(hào)為CGMCC?NO.?2060)中克隆負(fù)責(zé)豐加霉素生物合成的基因簇toyAM，并將該基因簇與鏈霉菌整合型質(zhì)粒pSET152連接，成功構(gòu)建了基因簇toyAM的重組載體pSET152-toyAM，并利用接合轉(zhuǎn)移法將其特異性的整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes)1628染色體上。

一種加強(qiáng)了基因簇toyAM表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，它過(guò)量表達(dá)了基因簇toyAM，具有比保藏編號(hào)為CGMCC?NO.?2060淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes)?1628更高的豐加霉素表達(dá)能力。

所述的原始菌為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes)1628。

所述的基因簇toyAM來(lái)自于待重組的原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes)1628。

所述的基因簇toyAM整合入原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes)1628染色體。

所述的加強(qiáng)了基因簇toyAM表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的構(gòu)建方法，過(guò)程如下：