[發明專利]用于基于血液樣品構建測序文庫的方法及其在確定胎兒遺傳異常中的用途

有效

• 申請號: 201410505310.9
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN105400864B
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 張艷艷;陳芳;蔣慧;郭宇來;曾鵬;徐訊;楊煥明;丹尼斯·G·博林格;弗拉迪米爾·I·巴什基洛夫;海曼舒·塞西
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12M1/34;C12M1/00;C40B50/06;C40B60/14
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種基于血液樣品構建測序文庫的方法，其特征在于，包括：

從所述血液樣品分離DNA樣品；

對所述DNA樣品進行去磷酸化處理以便獲得經過去磷酸化的DNA；

對所述經過去磷酸化的DNA進行末端修復，以便獲得雙鏈DNA片段，其中，所述雙鏈DNA片段具有兩個平端末端，并且四個末端核苷酸均缺少磷酸基團；

將相互不同的第一和第二接頭與所述雙鏈DNA片段相連，以便獲得第一連接產物，其中第一和第二接頭的每一個均是分離的寡核苷酸，所述分離的寡核苷酸包括：第一鏈，所述第一鏈的5’末端核苷酸具有磷酸基團，并且所述第一鏈的3’末端核苷酸為雙脫氧核苷酸；以及第二鏈，所述第二鏈的5’末端核苷酸不具有磷酸基團，并且所述第二鏈的3’末端核苷酸為雙脫氧核苷酸，其中，所述第一鏈的長度大于所述第二鏈的長度，并且所述第一鏈和所述第二鏈之間形成雙鏈結構；

利用第一單鏈DNA置換所述第一接頭的第二鏈，利用第二單鏈DNA置換所述第二接頭的第二鏈，以便獲得第二連接產物，其中，第一單鏈DNA適于與第一接頭的第一鏈形成雙鏈結構，所述第二單鏈DNA適于與第二接頭的第一鏈形成雙鏈結構；

利用第一引物和第二引物對所述第二連接產物進行擴增，其中，所述第一引物包括與所述第一單鏈DNA和第二單鏈DNA之一相同的序列，所述第二引物包括與所述第一單鏈DNA和第二單鏈DNA的另一個相同的序列，并且所述第一引物和第二引物之一具有額外的生物素標記，所述擴增產物是在兩個末端分別具有一個接頭的DNA片段；

從所述在兩個末端分別具有一個接頭的DNA片段分離單鏈DNA片段；以及

將所述單鏈DNA片段進行環化處理，以便獲得單鏈環狀DNA，所述單鏈環狀DNA構成所述測序文庫；

其中，從所述兩個末端分別連接具有一個接頭的DNA片段分離單鏈DNA片段進一步包括：

使所述兩個末端分別具有一個接頭的DNA片段與磁珠接觸，以便形成磁珠-DNA復合物，其中，所述磁珠上連接有鏈霉親和素；

將所述磁珠-DNA復合物與pH高于7的溶液接觸，以便獲得所述單鏈DNA片段。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液樣品為血漿。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA樣品為游離核酸樣品。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA樣品為從有核紅細胞分離的基因組DNA，并且在對所述DNA樣品進行所述去磷酸化處理之前，預先將所述基因組DNA進行打斷，以便獲得長度為100～200bp的DNA片段。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一接頭和所述第二接頭的每一個分別獨立地包括：

第一突出端，所述第一突出端位于所述第一鏈的3’端；以及

任選的第二突出端，所述第二突出端位于所述第二鏈的5’端。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一突出端的長度大于所述第二突出端的長度。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一突出端的長度為6～12nt。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二突出端的長度為0～4nt。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一鏈的長度為20～25nt。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二鏈的長度為10～15nt。

11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，將所述雙鏈DNA片段與第一接頭和第二接頭進行連接的步驟是在一步反應中完成的。