[發(fā)明專利]體液中乳糖測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410504960.1
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN104237147A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李立和;常玉芝;丁弘
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于一種包含酶的測定方法；或是利用可見光，通過測試反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生顏色變化來測試材料的方法，特別是涉及一種用生化分析儀檢測體液中乳糖的測定方法。

背景技術(shù)

乳糖是二糖的一種，分子式是C₁₂H₂₂O₁₁，是在哺乳動物乳汁中的雙糖，因此而得名，它的分子結(jié)構(gòu)是由一分子葡萄糖和一分子半乳糖縮合形成，味微甜，摩爾質(zhì)量342.3克，有兩種端基異構(gòu)體：α-乳糖和β-乳糖，在水溶液中可互相轉(zhuǎn)化，α-乳糖很容易結(jié)合一分子結(jié)晶水，甜度是蔗糖的約五分之一，乳汁中2～8％的固體成分為乳糖，幼小的哺乳動物腸道能分泌乳糖酶分解乳糖為單糖。成年動物，包括除高加索人種外的多數(shù)人類體內(nèi)乳糖酶的活性大大降低，故飲用乳類可產(chǎn)生腹瀉、腹脹等癥狀，稱為乳糖不耐癥，成年動物若長期持續(xù)飲用乳品(初期以少量多次慢飲為宜)，也可刺激腸道內(nèi)乳糖酶的活性并增加一定數(shù)量，雖活性和數(shù)量不如幼兒時(shí)期，但仍能有效幫助分解乳糖，乳糖在人體中存在于乳汁中，當(dāng)人體飲入乳品后，人體腸屏障破壞時(shí)可進(jìn)入人體血液和尿液中。

目前國內(nèi)測定乳糖有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法，還有酶學(xué)分析法，通過乳糖酶分解乳糖生成L-半乳糖和葡萄糖，通過檢測L-半乳糖的含量來確定乳糖的含量，如北京金域高科診斷技術(shù)有限公司生產(chǎn)采用尿半乳糖測定試劑盒，受檢患者排空尿液，按正常飲食習(xí)慣哺乳，收集2～3h的尿液，混勻檢測，乳糖經(jīng)乳糖酶作用水解生成葡萄糖和半乳糖，半乳糖吸收入血后經(jīng)尿液排出，尿液經(jīng)尿液純化裝置處理除去干擾物，尿中半乳糖經(jīng)半乳糖酶氧化酶作用生成半乳糖己二醛糖和過氧化氫，后者在四氨基安替吡啉存在下，使3，5-二氯-2-羥基苯磺酸氧化成紅色，在一定范圍內(nèi)呈色深度與半乳糖濃度成正比，與試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品對照判讀結(jié)果，樣品孔顏色與標(biāo)準(zhǔn)孔一致或較標(biāo)準(zhǔn)孔淺為乳糖不耐受即乳糖不能被水解生成葡萄糖和半乳糖，尿中無半乳糖檢驗(yàn)結(jié)果呈陽性為乳糖不耐受，反之乳糖耐受呈陰性。

本發(fā)明研究一種人體體液中乳糖測定方法，人體體液中葡萄糖和試劑Ⅰ中三磷酸腺苷、NADP在己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化下，在鎂離子的參與下反應(yīng)生成NADPH，加入試劑Ⅱ后于37℃溫浴4～7分鐘，乳糖水解后生成L-半乳糖和葡萄糖，葡萄糖再循環(huán)第一步反應(yīng)也生成NADPH；儀器在334～340nm波長處檢測，以試劑Ⅰ反應(yīng)產(chǎn)生的NADPH為空白，由試劑Ⅱ反應(yīng)產(chǎn)生的NADPH計(jì)算出乳糖的含量。

第一步反應(yīng)：

第二步反應(yīng)

發(fā)明內(nèi)容：

生化分析儀檢測體液中乳糖常采用酶法，人體體液中含有乳糖及葡萄糖，通過葡萄糖內(nèi)空白法檢測乳糖，人體體液中的葡萄糖與試劑Ⅰ中三磷酸腺苷、NADP在己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化下，在鎂離子的參與下反應(yīng)生成NADPH，反應(yīng)公式(1)(2)所示；當(dāng)加入試劑II后，乳糖酶分解乳糖生成L-半乳糖和葡萄糖，葡萄糖再循環(huán)第一步反應(yīng)也生成NADPH，反應(yīng)公式(3)(4)(5)所示，乳糖水解產(chǎn)生的葡萄糖與乳糖含量呈等比關(guān)系，儀器在334～340nm波長處檢測，以試劑Ⅰ反應(yīng)產(chǎn)生的NADPH為空白，由試劑Ⅱ反應(yīng)產(chǎn)生的NADPH計(jì)算出乳糖的含量即為乳糖含量。本發(fā)明方法測定乳糖不受體液中葡萄糖含量的影響，通過內(nèi)空白法消除了體液中的葡萄糖、內(nèi)源性還原物質(zhì)、脂濁、體液空白的干擾，為真正的乳糖含量。

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中體液中內(nèi)源性葡萄糖、脂濁、體液本身顏色對測定的干擾，本發(fā)明提供一種經(jīng)濟(jì)方便易行，準(zhǔn)確性更高、適應(yīng)于乳汁、血液、體液、尿液中乳糖檢測，能夠消除內(nèi)源性干擾的體液中乳糖的測定方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：工具酶及指示酶同在試劑I中，試劑II僅有乳糖酶有效成分；其測定方法為：體液中葡萄糖先與試劑Ⅰ于37℃溫浴3～5分鐘，體液中葡萄糖與試劑Ⅰ反應(yīng)生成NADPH，加入試劑Ⅱ后于37℃溫浴4～7分鐘，乳糖水解后生成L-半乳糖和葡萄糖，葡萄糖經(jīng)反應(yīng)產(chǎn)生NADPH，334～340nm波長處檢測，以試劑Ⅰ反應(yīng)產(chǎn)生的NADPH為空白，由試劑Ⅱ反應(yīng)產(chǎn)生的NADPH計(jì)算出乳糖的含量。