[發明專利]一種基于實時熒光PCR檢測HLA?B*5801等位基因的方法

有效

• 申請號: 201410503857.5
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN104293932B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 康星;王會娟;陳融;劉金輝;戴鵬高;陳超
• 申請（專利權）人: 陜西佰美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司61211
• 代理人: 胡樂

1.用于熒光PCR反應高特異性擴增HLA-B*5801等位基因的引物探針組合，包括：

上游引物Fp：5’‐AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’；

下游引物Rp:5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’；

MGB探針：5’‐HEX/VIC‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB‐3’；

其中，HEX為6‐carboxy‐hexachlorofluorescein。

2.一種基于實時熒光PCR檢測HLA-B*5801等位基因的方法，用于非疾病診斷目的，主要包括以下環節：

(1)針對HLA‐B*5801等位基因設計特異性引物和探針，即權利要求1所述的引物探針組合；并設計內參基因的引物和探針；

(2)獲得抽提的待測樣本基因組DNA；

(3)在同一個反應體系中，將待測樣本基因組DNA與所述引物探針組合以及內參基因的引物和探針按照確定比例混合；

(4)通過Applied?Biosystem?7500或者LightCycler?System480進行實時定量熒光PCR檢測，其中分別利用FAM通道和VIC通道進行雙通道熒光采集；

(6)分析判斷待測樣本是否攜帶HLA‐B*5801等位基因。

3.根據權利要求2所述的基于實時熒光PCR檢測HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于，環節(1)中設計內參基因β‐actin引物和探針為：

上游引物Actin‐F:5’‐CAGCAGATGTGGATCAGCAAG‐3’；

下游引物Actin‐R:5’‐GCATTTGCGGTGGACGAT‐3’；

探針probe:5’‐FAM‐AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2‐3’；

其中，FAM為6‐carboxyfluorescein；BHQ2為Minor?Groove?Binder。

4.根據權利要求3所述的基于實時熒光PCR檢測HLA-B*5801等位基因的方法，其特征在于：使用Premix?Ex?Taq試劑盒(TaKaRa)進行PCR擴增，所述反應體系以20μL計，則包括：10μL?Premix?Ex?Taq(2×)、HLA‐B*5801特異性上游引物Fp?250nM‐500nM、下游引物Rp?250nM‐500nM、MGB探針100nM‐250nM、以及ACTB特異性上游引物Actin‐F100nM‐250nM、下游引物Actin‐R?100nM‐250nM、探針probe?50nM‐250nM，然后加入待測樣本基因組DNA10ng‐50ng，補充PCR等級的水至終體積20μL；

擴增程序為：95℃預變性30s；95℃?5s～10sec，64℃?34s～40sec，共計35～40個循環。