[發(fā)明專利]一種定量RNaseH活性測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410502173.3
• 申請日: 2014-09-28
• 公開（公告）號: CN104293931B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐曉昱;王靜
• 申請（專利權(quán)）人: 南京諾唯贊生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/44
• 代理公司: 南京正聯(lián)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司32243
• 代理人: 王素琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生化技術(shù)領(lǐng)域，具體來說涉及一種定量RNaseH活性測定方法。

背景技術(shù)

RNaseH，即核糖核酸酶H，是一種核糖核酸內(nèi)切酶，可以特異性地水解DNA-RNA雜合鏈中的RNA。RNase?H是基因工程技術(shù)中一種重要的工具酶，其應(yīng)用包括cDNA第二條鏈合成前去除mRNA；通過互補(bǔ)的DNA序列實現(xiàn)對RNA的定點剪切；除去雜交到poly(dT)上的mRNA中的poly(A)；體外多腺苷酸化反應(yīng)(polyadenylation?reaction)產(chǎn)物研究。此外，RNaseH在逆轉(zhuǎn)錄病毒中起著非常重要的作用，并且也是目前非轉(zhuǎn)錄病毒的重要藥物靶標(biāo)。因此，精確、快速、簡便測定RNase?H活性，可以保證RNase?H作為工具酶的質(zhì)量穩(wěn)定性，且有助于促進(jìn)抗病毒藥物的開發(fā)，具有極大的理論和現(xiàn)實意義。

標(biāo)準(zhǔn)的RNaseH測活方法采用放射性同位素法。將RNaseH進(jìn)行2倍連續(xù)梯度稀釋，加入到含³H-poly(rA)、poly?(dT)?DNA和1×?RnaseH緩沖液的50μL反應(yīng)體系中，37℃條件下孵育，產(chǎn)物用TCA沉淀并加在whatman濾紙上，就可以實現(xiàn)摻入產(chǎn)物和標(biāo)記物的分離。再經(jīng)過洗滌、干燥、洗脫，最后測定酸可溶性物質(zhì)中放射性同位素的量，就可以計算出RNase?H的活性。這種方法存在易產(chǎn)生放射性污染、步驟多、周期長的缺陷，難以實現(xiàn)高通量、自動化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于建立一種簡便、快速、非放射性且定量的RNaseH測活方法，其原理如圖1所示。

具體來說，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種定量RNaseH活性測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：以一段RNA模板為底物，在DNA引物存在下，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，形成DNA-RNA雜合鏈；以該DNA-RNA雜合鏈為底物，加入RNaseH酶，進(jìn)行降解反應(yīng)；降解反應(yīng)后測定DNA單鏈或DNA-RNA雜合鏈的相對量，由該測定結(jié)果推導(dǎo)出RNaseH酶的活性程度。

優(yōu)選地，DNA單鏈或DNA-RNA雜合鏈的相對量是利用熒光染料，通過熒光法測得的，并且該相對量是以熒光強(qiáng)度表示的。更優(yōu)選，所用的熒光染料是雙鏈特異性熒光染料。在一個實施方案中，所用的雙鏈特異性熒光染料是商購的picogreen染料。

RNA模板可以采用任何適合長度的RNA單鏈，只要能方便地測定RNaseH酶活即可。在一個實施方案中，所用RNA模板為一段polyA?RNA單鏈，所用的DNA引物為Oligo?dT。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1.?無放射性污染；

2.?操作步驟簡單，重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，反應(yīng)迅速；

3.?逆轉(zhuǎn)錄方法得到的DNA-RNA雜合鏈可直接用于RNaseH的測活，不需要再經(jīng)過酚氯仿抽題、乙醇沉淀等步驟；

4.?可以對RNaseH活性進(jìn)行定量的檢測分析，便于操作。

附圖說明

圖1為本發(fā)明測定方法的原理圖。

圖2為通過本發(fā)明方法測得的RNaseH活性-熒光強(qiáng)度曲線圖。

圖3為不同來源RNaseH的酶活-熒光強(qiáng)度曲線圖。

具體實施方式

本發(fā)明建立了一種簡便、快速、非放射性且定量的RNaseH測活方法，其原理如圖1所示。

如圖1所示，本發(fā)明選擇polyA作為RNA單鏈，以O(shè)ligo?dT為引物，先用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行相匹配的cDNA鏈的合成，生成的DNA-RNA雜合鏈作為本測活方法中的底物。若加入RNaseH，則該酶會降解DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈，產(chǎn)生一條DNA單鏈，該單鏈不能被雙鏈特異性的picogreen染料結(jié)合，不產(chǎn)生熒光；若不加入RNaseH，體系中仍是DNA-RNA雜合鏈的結(jié)構(gòu)，則可以被雙鏈特異性的picogreen染料結(jié)合，發(fā)出熒光。

由此可見，RNaseH的活性在一定范圍內(nèi)同DNA-RNA雜合鏈的量成反比，而DNA-RNA雜合鏈的量在一定情況下，同熒光強(qiáng)度成正比。因此，RNaseH的活性就可以用picogreen熒光強(qiáng)度來進(jìn)行測定。

本發(fā)明人進(jìn)一步證明了上述假設(shè)，從而建立了非放射性、簡便、快速且可以定量的RNaseH測活方法。

下面將結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。

實施例1.?熒光法測定RNaseH活性方法的建立

1.?構(gòu)建DNA+RNA雜合鏈體系：

逆轉(zhuǎn)錄酶為PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa?2680A)