[發明專利]一種定量RNaseH活性測定方法

有效

• 申請號: 201410502173.3
• 申請日: 2014-09-28
• 公開（公告）號: CN104293931B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 徐曉昱;王靜
• 申請（專利權）人: 南京諾唯贊生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/44
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司32243
• 代理人: 王素琴

技術領域

本發明屬于生化技術領域，具體來說涉及一種定量RNaseH活性測定方法。

背景技術

RNaseH，即核糖核酸酶H，是一種核糖核酸內切酶，可以特異性地水解DNA-RNA雜合鏈中的RNA。RNase?H是基因工程技術中一種重要的工具酶，其應用包括cDNA第二條鏈合成前去除mRNA；通過互補的DNA序列實現對RNA的定點剪切；除去雜交到poly(dT)上的mRNA中的poly(A)；體外多腺苷酸化反應(polyadenylation?reaction)產物研究。此外，RNaseH在逆轉錄病毒中起著非常重要的作用，并且也是目前非轉錄病毒的重要藥物靶標。因此，精確、快速、簡便測定RNase?H活性，可以保證RNase?H作為工具酶的質量穩定性，且有助于促進抗病毒藥物的開發，具有極大的理論和現實意義。

標準的RNaseH測活方法采用放射性同位素法。將RNaseH進行2倍連續梯度稀釋，加入到含³H-poly(rA)、poly?(dT)?DNA和1×?RnaseH緩沖液的50μL反應體系中，37℃條件下孵育，產物用TCA沉淀并加在whatman濾紙上，就可以實現摻入產物和標記物的分離。再經過洗滌、干燥、洗脫，最后測定酸可溶性物質中放射性同位素的量，就可以計算出RNase?H的活性。這種方法存在易產生放射性污染、步驟多、周期長的缺陷，難以實現高通量、自動化。

發明內容

本發明的目的在于建立一種簡便、快速、非放射性且定量的RNaseH測活方法，其原理如圖1所示。

具體來說，本發明采用了如下技術方案：

一種定量RNaseH活性測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：以一段RNA模板為底物，在DNA引物存在下，利用逆轉錄酶合成cDNA，形成DNA-RNA雜合鏈；以該DNA-RNA雜合鏈為底物，加入RNaseH酶，進行降解反應；降解反應后測定DNA單鏈或DNA-RNA雜合鏈的相對量，由該測定結果推導出RNaseH酶的活性程度。

優選地，DNA單鏈或DNA-RNA雜合鏈的相對量是利用熒光染料，通過熒光法測得的，并且該相對量是以熒光強度表示的。更優選，所用的熒光染料是雙鏈特異性熒光染料。在一個實施方案中，所用的雙鏈特異性熒光染料是商購的picogreen染料。

RNA模板可以采用任何適合長度的RNA單鏈，只要能方便地測定RNaseH酶活即可。在一個實施方案中，所用RNA模板為一段polyA?RNA單鏈，所用的DNA引物為Oligo?dT。

本發明的優點：

1.?無放射性污染；

2.?操作步驟簡單，重復性好，穩定性強，反應迅速；

3.?逆轉錄方法得到的DNA-RNA雜合鏈可直接用于RNaseH的測活，不需要再經過酚氯仿抽題、乙醇沉淀等步驟；

4.?可以對RNaseH活性進行定量的檢測分析，便于操作。

附圖說明

圖1為本發明測定方法的原理圖。

圖2為通過本發明方法測得的RNaseH活性-熒光強度曲線圖。

圖3為不同來源RNaseH的酶活-熒光強度曲線圖。

具體實施方式

本發明建立了一種簡便、快速、非放射性且定量的RNaseH測活方法，其原理如圖1所示。

如圖1所示，本發明選擇polyA作為RNA單鏈，以Oligo?dT為引物，先用逆轉錄酶進行相匹配的cDNA鏈的合成，生成的DNA-RNA雜合鏈作為本測活方法中的底物。若加入RNaseH，則該酶會降解DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈，產生一條DNA單鏈，該單鏈不能被雙鏈特異性的picogreen染料結合，不產生熒光；若不加入RNaseH，體系中仍是DNA-RNA雜合鏈的結構，則可以被雙鏈特異性的picogreen染料結合，發出熒光。

由此可見，RNaseH的活性在一定范圍內同DNA-RNA雜合鏈的量成反比，而DNA-RNA雜合鏈的量在一定情況下，同熒光強度成正比。因此，RNaseH的活性就可以用picogreen熒光強度來進行測定。

本發明人進一步證明了上述假設，從而建立了非放射性、簡便、快速且可以定量的RNaseH測活方法。

下面將結合具體實施例來進一步說明本發明。

實施例1.?熒光法測定RNaseH活性方法的建立

1.?構建DNA+RNA雜合鏈體系：

逆轉錄酶為PrimeScript逆轉錄酶(TaKaRa?2680A)