[發明專利]一種T4 DNA聚合酶活性測定方法

無效

• 申請號: 201410502171.4
• 申請日: 2014-09-28
• 公開（公告）號: CN104313132A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 徐曉昱;劉來花;王靜
• 申請（專利權）人: 南京諾唯贊生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/48
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 王素琴

技術領域

本發明屬于生化技術領域，具體來說涉及一種T4?DNA聚合酶活性測定方法。

背景技術

T4?DNA聚合酶由T4噬菌體聚合酶I基因編碼，具有5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性。T4?DNA聚合酶是基因工程技術中一種重要的工具酶，可用于雙鏈DNA末端的平滑化。在高通量測序（next?generation?sequencing）文庫構建的過程中，片段化的DNA末端首先需要用T4?DNA聚合酶平滑化，再經過T4多聚核苷酸激酶加磷酸后，才能與雙鏈DNA接頭進行連接。

標準的T4?DNA聚合酶測活方法采用放射性同位素法。T4?DNA聚合酶可以催化將³²P標記的dNTP摻入到小牛胸腺DNA中。經過TCA沉淀、whatman濾紙過濾，通過測定酸不溶性物質中放射性的含量，計算聚合酶活性。這種方法易產生放射性污染，且步驟多、周期長，難以實現高通量、自動化。

Seville等（Biotechniques.?1996?Oct；21(4):664）建立了一種基于熒光的DNA聚合酶活性測定方法，其原理如圖1所示。

DNA聚合酶可以M13單鏈環狀DNA為模板催化聚合反應，生成M13雙鏈環狀DNA。雙鏈環狀DNA產物可以被雙鏈DNA特異性的picogreen染料結合，產生熒光，從而測定DNA聚合酶活性。

但是本發明人發現，這種方式不適用于T4?DNA聚合酶的活性測定。因為T4?DNA聚合酶具有很強的3’-5’外切酶活性，在該測活體系中，3’-5’外切酶活性會在很大程度上抵消聚合酶活性，造成聚合酶活性難以測定。

發明內容

本發明的目的在于建立一種非放射性、簡便、快速的外切酶活性測定方法，其原理如圖2所示。

具體來說，本發明采用的是以下技術方案：

一種T4?DNA聚合酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：在無dNTP存在的情況下，在以雙鏈線性DNA模板為底物的反應體系中加入T4?DNA聚合酶，反應完成后檢測雙鏈DNA的相對量，由此測出T4?DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4?DNA聚合酶的外切酶活性與聚合酶活性相關，得到T4?DNA聚合酶的聚合酶活性程度。

優選地，雙鏈DNA的相對量是利用熒光染料，例如僅與雙鏈DNA或僅與單鏈DNA結合的熒光染料，通過熒光法測得的，并且雙鏈DNA的相對量是以熒光強度表示的。

更優選，所采用的熒光染料是雙鏈DNA特異性熒光染料，更優選為市售的成熟商用熒光染料，例如picogreen染料。

在一個實施方案中，本發明方法中所采用的雙鏈線性DNA模板是以λDNA為底物，在正向和反向引物的存在下通過PCR擴增獲得的線性雙鏈DNA，以便建立一種標準的測量方法。

在一個進一步的實施方案中，所用正向引物為5’-aataacgtcggcaactttgg-3’，反向引物為5’-gttacgccaccagtcatcct-3’。

本發明的優點：

1.?無放射性污染；

2.?操作步驟簡單快速，無需TCA沉淀、洗滌、干燥、洗脫步驟；可實現高通量、自動化的活性測定。

3.?建立了T4?DNA聚合酶的外切酶活性和聚合酶活性的定量關系，通過方便的測定外切酶活性，克服了外切酶活性對聚合酶活性測定的干擾，測量結果更準確。

附圖說明

圖1是現有技術中測定DNA聚合酶活性的技術原理圖。

圖2是本發明的測定T4?DNA聚合酶活性的技術原理圖。

圖3是現有技術的熒光法測定大腸桿菌pol?I和T4?DNA聚合酶獲得的熒光酶活曲線圖。

圖4是利用本發明的方法測定T4?DNA聚合酶獲得的熒光酶活曲線圖。

圖5是不同來源的T4?DNA聚合酶的熒光酶活曲線圖。

具體實施方式