[發明專利]一種3’-5’外切酶活性測定方法

有效

• 申請號: 201410502154.0
• 申請日: 2014-09-28
• 公開（公告）號: CN104293930A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 徐曉昱;王靜
• 申請（專利權）人: 南京諾唯贊生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/44
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 王素琴

技術領域

本發明屬于生化技術領域，具體來說涉及一種3’-5’外切酶活性測定方法。?

背景技術

Pfu?DNA聚合酶（簡稱Pfu）是一種來源于嗜熱菌強烈熾熱球菌（Pyrococcus?furiosus）的高度熱穩定的DNA聚合酶。Pfu具有兩種活性：5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性（或稱校對活性）。Pfu的3’-5’外切酶活性非常強，可以降解DNA合成鏈中堿基錯配的核苷酸，大大增加了堿基配對的正確率，保證了DNA合成的高度忠實性。因此，該酶是目前耐熱DNA聚合酶中保真度最高的酶，適合使用在那些需要高精確度的PCR應用中，包括克隆、基因表達和突變分析。?

Pfu的高3’-5’外切酶活性雖然可以帶來高的保真度，但同時也會引起一些副作用。3’-5’外切酶活性會降解引物，特別是溶液中沒有dNTP的情況下。所以，在配制PCR反應體系時，最好在冰上操作，且Pfu必須是最后加入到反應體系中，并立即進行PCR反應。另外，Pfu擴增產物為平端。如果需要進行TA克隆的話，需要首先將PCR產物純化，去掉Pfu，再進行加A尾反應；否則，Pfu的3’-5’外切酶活性會將加上的A切掉，導致TA克隆失敗。因此，業內一直希望找到一種可逆的封閉Pfu?3’-5’外切酶活性的方法，旨在不改變Pfu高保真度的前提下，減少甚至消除3’-5’外切酶活性帶來的副作用，以提高Pfu相關應用的便利性。?

但是找到在找到相應的封閉活性方法之前，首先要解決的一個問題是如何建立3’-5’外切酶活性的方法。標準的測活方法采用放射性同位素法，即首先合成一條3’末端帶³H標記dATP的單鏈寡核苷酸。3’-5’外切酶活性可將[³H]-dATP切除。再經過TCA沉淀、過濾，通過測定酸可溶性物質中放射性的含量，計算3’-5’外切酶活性。這種方法易產生放射性污染，且步驟多、周期長，難以實現高通量、自動化，因此為篩選帶來了困難。?

發明內容

本發明建立了一種簡便、快速、非放射性的3’-5’外切酶測活方法，利用該方法，可以快速大量的篩選目標產物，為尋找針對該3’-5’外切酶活性的封閉試劑提供了一種可靠簡便的途徑。?

具體來說，本發明采用的技術方案如下：?

一種3’-5’外切酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括：首先根據單鏈模板合成有3’錯配的引物，將引物與單鏈模板混合并退火，接著在該反應液中加入3’-5’外切酶活性進行3’堿基外切反應，然后加入足量沒有3’-5’外切酶活性的聚合酶延長引物直至獲得雙鏈DNA，隨后檢測反應體系中雙鏈DNA的相對量，并根據檢測結果推導出3’-5’外切酶活性程度。

其中，反應體系中雙鏈DNA的相對量可以通過檢測雙鏈DNA的量或者單鏈DNA的量而得到。?

優選地，反應體系中單鏈DNA的存在量的檢測是利用僅與雙鏈DNA或僅與單鏈DNA結合的熒光染料，更優選采用雙鏈DNA特異性熒光染料，在一個實施方案中，本發明方案中采用的是當前在本領域中已經成熟使用的商購picogreen染料。在此，雙鏈DNA的相對量是以熒光強度表示的。?

本發明測定方法中所采用的單鏈模板可以選用任何適合的單鏈模板，優選采用環狀單鏈DNA，這樣在聚合反應結束后，可以得到閉合的環狀雙鏈體，處理技術成熟，并且環狀雙鏈體可以避免對后續測量的干擾。在一個優選實施方案中，所采用的單鏈模板是M13噬菌體單鏈DNA，簡稱M13。M13是在生化技術中廣泛使用的一種單鏈DNA載體，因此可以此為基礎建立一種標準的測量技術。?

所述測定方法中錯配引物中3’錯配的數目優選是1個。?

在一個優選實施方案中，所采用的引物序列是5’-aagccatccgcaaaaatgacctcta-3’，其中加下劃線的堿基表示錯配堿基。?

所加入的沒有3’-5’外切酶活性的聚合酶可以采用任何適合的DNA聚合酶，在一個優選實施方案中，所采用的沒有3’-5’外切酶活性的聚合酶是指Taq酶。?

在另一實施方案中，所要測定的3’-5’外切酶活性是指具有3’-5’外切酶活性的Pfu酶。?

本發明的優點：?

1.無放射性污染；

2.操作步驟簡單快速，無需TCA沉淀、洗滌、干燥、洗脫步驟；可實現高通量、自動化的活性測定；

3.可以用來針對3’-5’外切酶活性進行阻斷活性篩選。

附圖說明