[發明專利]一種定量核酸外切酶I活性測定方法

在審

• 申請號: 201410502152.1
• 申請日: 2014-09-28
• 公開（公告）號: CN104293928A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 曹林;徐曉昱;王靜
• 申請（專利權）人: 南京諾唯贊生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/44
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 王素琴

技術領域

本發明屬于生化技術領域，具體來說涉及一種定量核酸外切酶I活性測定方法。?

背景技術

核酸外切酶I（Exonuclease?I,?ExoI）是單鏈特異性3’→5’核酸外切酶，從ssDNA的3’-OH末端分解生成5’-單核苷酸。對單鏈DNA的特異性非常高，不分解雙鏈DNA及RNA。?

核酸外切酶I對單鏈DNA的高度特異性，使其成為分子生物學領域中一種非常重要的工具酶，應用非常廣泛。例如，在PCR反應完成后，在產物中直接加入核酸外切酶I和蝦堿性磷酸酶，降解剩余的引物和dNTP。消化過的PCR產物經過80℃加熱后，即可直接進行測序反應而不需要純化。?

標準的核酸外切酶I測活方法采用放射性同位素法。核酸外切酶I以3’末端[³H]標記的單鏈寡核苷酸為底物，生成帶[³H]標記的dNTP。產物經TCA沉淀后，用whatman濾紙過濾，以實現[³H]標記的dNTP和寡核苷酸的分離。通過測定酸可溶性產物中的放射性同位素的量，計算核酸外切酶I的活性。放射性同位素法存在易產生放射性污染、步驟多、周期長的缺陷，難以實現高通量、自動化。?

發明內容

本發明的目的在于建立了一種簡便、快速、非放射性且定量的核酸外切酶I測活方法，其原理如圖1所示。?

具體來說，本發明采用如下技術方案：?

一種定量核酸外切酶I活性測定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：首先提供與單鏈DNA模板互補的引物，隨后加入核酸外切酶I進行外切反應；外切反應后，加入單鏈DNA模板并退火，形成單鏈DNA模板/引物復合物；其后加入聚合酶，合成雙鏈DNA；接著測定反應體系中單鏈或雙鏈DNA的相對量，并由測定結果推導出核酸外切酶I活性程度，其中核酸外切酶I活性程度與反應體系中雙鏈DNA的量成反比。

優選地，雙鏈DNA或單鏈DNA的相對量是利用熒光染料，通過熒光法測得的，并且雙鏈DNA或單鏈DNA的相對量是以熒光強度表示的。更優選，所采用的熒光染料是雙鏈DNA特異性熒光染料，例如可在市面上商購獲得的picogreen染料。?

優選地，所采用的單鏈DNA模板是單鏈環狀DNA模板。更優選，所采用的單鏈DNA模板是M13噬菌體單鏈DNA，以便于建立標準測定方法。?

作為標準測定方法的一個實例，所采用的聚合酶為Taq酶。?

本發明的優點：?

1.?無放射性污染；

2.?操作步驟簡單，重復性好，穩定性強，反應迅速；

3.?可以對核酸外切酶Ⅰ活性進行定量的檢測分析，便于操作。

附圖說明

圖1是本發明測定方法原理圖。?

圖2是核酸外切酶Ⅰ活性-熒光強度曲線圖。?

具體實施方式

本發明建立了一種簡便、快速、非放射性且定量的核酸外切酶I測活方法，其原理如圖1所示。?

如圖1所示，加入單鏈DNA，如M13?ssDNA后，單鏈DNA引物可與其形成匹配的模板/引物復合物，如M13模板/引物復合物，Taq酶可以模板/引物復合物如M13模板/引物復合物為底物，進行聚合反應，生成M13雙鏈DNA。M13雙鏈DNA可被雙鏈特異性的picogreen染料結合，產生熒光。ExoI酶可降解單鏈DNA引物，從而減少M13模板/引物復合物的量。ExoI酶的活性在一定范圍內同M13模板/引物復合物的量成反比；而在DNA聚合酶活性一定的情況下，M13模板/引物復合物的量同熒光強度成正比。因此，本發明將ExoI酶的測活體系同DNA聚合酶測活體系偶聯起來，在一定范圍內，ExoI酶的活性同熒光強度成反比。?

本發明人進一步證明了上述假設，從而建立了非放射性、簡便、快速且可以定量的核酸外切酶Ⅰ測活方法。?

作為本發明測定方法的一個實例，一個采用M13單鏈DNA作為單鏈模板的本發明測定方法包括如下基本步驟：?

M13單鏈DNA：M13mp18單鏈DNA?(NEB)；

單鏈DNA引物：M13引物5’-aagccatccgcaaaa-3’;

1.?ExoⅠ反應：

2.?聚合酶反應：

3.?picogreen熒光檢測：