[發明專利]一種三維結構rGO-MWCNT-Pd無標記豬細小病毒傳感器制備方法及應用

有效

• 申請號: 201410499241.5
• 申請日: 2014-09-26
• 公開（公告）號: CN104297473A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 曹偉;劉蕾;魏琴;閆濤;馬洪敏;朱寶存;李月云;吳丹
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N27/327;G01N27/48
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技術領域

本發明涉及一種三維結構rGO-MWCNT-Pd無標記豬細小病毒傳感器制備方法及應用，屬于新型功能材料、生物傳感技術領域。

背景技術

豬細小病毒會引起一種豬繁殖障礙病，豬細小病毒病，該病主要表現為胚胎和胎兒的感染和死亡，特別是初產母豬發生死胎、畸形胎和木乃伊胎，但母豬本身無明顯的癥狀。目前，該病在世界范圍內廣泛分布，在大多數感染豬場呈地方性流行，豬群感染后很難凈化，從而造成了持續的經濟損失，現已是我國較常見的豬病之一。因此豬細小病毒的快速靈敏檢測就顯得尤為重要。

免疫傳感器是將免疫學方法與分析化學方法相結合的一種生物傳感器，通過抗原與抗體之間的特異性結合，顯著提高了傳感器的選擇性。

電化學免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、結構簡單、操作簡便、易于小型化、可連續、快速自動化檢測分析等優點。

近年來，零維的富勒烯，一維的碳納米管以及二維石墨烯等碳基材料因其獨特的性質而被廣泛應用。本發明制備了三維的碳基雜化材料rGO-MWCNT，將rGO的優異的導電性和MWCNT大的比表面積結合起來，并且在其三維結構中插入了Pd納米粒子，利用貴金屬可以和抗體直接形成Pd-NH鍵，實現抗體在電極表面的固定；三維的rGO-MWCNT可以容納更多的Pd納米粒子，并且其自身也具有優異的電子傳導能力，起到了增強電化學信號的作用。該方法具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速等優點，而且制備過程簡單。

發明內容

本發明的目的之一是基于rGO-MWCNT-Pd納米復合物，構建了一種無酶、無標記的電化學免疫傳感器。

本發明的目的之二是將該傳感器應用于豬細小病毒的高靈敏、特異性檢測。

本發明的技術方案如下：

1.?一種三維結構rGO-MWCNT-Pd無標記豬細小病毒傳感器制備方法步驟如下：

（1）將直徑為4?mm的玻碳電極用Al₂O₃拋光粉打磨，超純水清洗干凈；滴加?6μL、0.5?~?2?mg/mL?的三維結構的rGO-MWCNT-Pd納米復合物溶液于電極表面，?室溫下晾干；

（2）滴加6?μL、5~10?μg/mL?的豬細小病毒抗體于電極表面，4?℃冰箱中晾干，超純水沖洗，4?℃冰箱中晾干；

（3）滴加3?μL、質量分數為1~2%的BSA溶液于電極表面，封閉電極表面上非特異性活性位點，4?℃冰箱中晾干，超純水沖洗，4?℃冰箱中晾干；

（4）滴加6?μL、0.01~25?ng/mL的一系列不同濃度的豬細小病毒抗原標準溶液于電極表面，4?℃冰箱中晾干，超純水沖洗，4?℃冰箱中晾干，制得一種三維結構rGO-MWCNT-Pd無標記豬細小病毒傳感器。

2.?三維結構的rGO-MWCNT-Pd納米復合物溶液的制備，步驟如下：?

（1）三維結構的rGO-MWCNT納米復合物的制備

將20~40mg的多壁碳納米管MWCNT?加入到30?mL、?1~3?mg/mL?的氧化石墨烯均勻分散的溶液中，超聲30?min，將得到混合物置于50?mL?的高壓反應釜中，加熱到160~190℃，保持12?h，冷卻到室溫，制得三維結構的rGO-MWCNT納米復合物，冷凍干燥12?h；

（2）三維結構的rGO-MWCNT-Pd?納米復合物溶液的制備

在劇烈攪拌的條件下，將?1mL?、7~13?mmol/L?的K₂PdCl_4?和5?mg?的三維結構的rGO-MWCNT?納米復合物加入到10?mL的超純水中，冰浴30min，將得到混合物在7000?rpm下，離心分離5?min，用水洗滌，離心分離3次，35~50℃下真空干燥12h，制得三維結構的rGO-MWCNT-Pd納米復合物，用超純水配制成0.5?~?2?mg/mL?的三維結構的rGO-MWCNT-Pd納米復合物溶液。

3.?豬細小病毒的檢測，步驟如下：

（1）使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的無標記豬細小病毒傳感器為工作電極，在15?mL、40~60mmol/L、pH?6.0~8.0的鐵氰化鉀的PBS緩沖溶液中進行測試；

（2）用方波伏安方法對豬細小病毒抗原標準溶液進行檢測，輸入電壓范圍為-0.2~0.6?V，靈敏度10^-4，掃描速度50?mV/s，繪制工作曲線；

（3）將待測樣品溶液代替豬細小病毒抗原的標準溶液進行檢測。?