[發明專利]具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株以及由該減毒株制備得到的疫苗

有效

• 申請號: 201410498365.1
• 申請日: 2014-09-25
• 公開（公告）號: CN104312985A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 呂宏亮;張澍
• 申請（專利權）人: 呂宏亮;張澍
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N7/06;A61K39/15;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

技術領域

本發明涉及一種輪狀病毒減毒株及由該減毒株制備得到的疫苗，特別涉及一種安全且具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株、由該減毒株制備得到的疫苗及其制備方法，本發明屬于輪狀病毒感染的防治技術領域。

背景技術

輪狀病毒(RV)引起腹瀉在發展中國家是一種嚴重的傳染性疾病，每年引起約5萬5歲以下兒童死亡。輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科，分A、B、C?3個群，在人和動物中都有感染。輪狀病毒三層外殼蛋白內有11個不分節的雙鏈RNA，外殼蛋白VP7、VP4是病毒誘導中和抗體產生的主要免疫原，內膜蛋白VP6是亞群的分類依據。目前根據VP7和VP4基因分型發現有27G和35P血清型輪狀病毒。人的輪狀病毒的流行病學研究中發現，普遍流行以G1、G2、G3、G4和P[4]、P[6]、P[8]單獨或混合感染為主，也流行G9P[8]，中國主要流行G1P[8]、G3P[8]、G2P[8]、G4[8]，少有P2、P4流行。

采用單價人、動物和人-動物重配減毒疫苗口服免疫是預防輪狀病毒引起的腹瀉、引起死亡和減少住院、腹瀉癥狀的主要手段。

輪狀病毒感染在人和動物中非常普遍，是發展中國家的嚴重經濟負擔，也是威脅人類健康的公共衛生問題。為預防輪狀病毒感染，全球已經開發了口服多價或單價的輪狀病毒疫苗，臨床效果顯示安全和有效，但動物和人輪狀病毒的多樣性以及輪狀病毒的流行性和自身特點，使得減毒活疫苗的使用仍存在安全隱患，如動物和人輪狀病毒的變異、重組，人和動物病毒的跨種屬傳播等，因此開發一種安全廣譜的疫苗顯得更加迫切。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株。

本發明的目的之二在于提供一種用于預防輪狀病毒感染所引起的疾病的減毒活疫苗或滅活疫苗及其制備方法。

為了達到上述目的本發明采用了以下技術手段：

本發明發明人于2011年在國內某醫院收集兒童急性輪狀腹瀉病糞便樣本10例，用20％PBS(pH＝7.3)重懸無菌過濾，3000g離心20分鐘，吸取0.1ml上清液加入胰酶(20ug/ml)混合30分鐘，接種經PBS洗滌3次單層MA-104細胞(T-25細胞培養液含MEM、雙抗(100U慶大霉素和100ug鏈霉素)和8-10％胎牛血清)，37℃孵育1小時，加入病毒維持液(含MEN和0.5ug/ml胰酶)在37℃培養10-15天，凍融3次再以2000g離心20分鐘，取上清液和胰酶(20ug/ml)混合30分鐘后用MEM稀釋20倍接種MA104細胞在37℃培養8-9天，重復傳代8-10代至病毒潛伏期至2-3天。分離得到的病毒經Vero細胞分離傳代15代，分離的病毒能夠在猴腎細胞上穩定增值且具有細胞病變效應。

經基因分型鑒定，由本發明分離得到的輪狀病毒(命名為HRV-LZ-2013)的基因型為G10P8。與其它報道的人輪狀病毒G10型核苷酸序列不一致，與動物輪狀病毒LLR株G核苷酸同源性＜90％。該株P型核苷酸序列與輪狀病毒同源性﹥90％。RNA-SDS?PAGE試驗表明其11節RNA屬于長型。

本發明的一種具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株，命名為HRV-LZ-2013，基因分型為G10P8，分類命名為人輪狀病毒，其菌種保藏編號為：CGMCC?No.9452，保藏時間是:2014年7月8日，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

經本發明分離得到一種輪狀病毒減毒株HRV-LZ-2013，其在細胞上病毒滴度高，傳代穩定，用該毒株制備減毒活疫苗，對動物低致病性或無致病性，安全、廣譜。制備滅活疫苗，經滅活和純化，病毒結構仍能夠保持完整并可誘導多種動物產生中和抗體，從而對異型病毒的攻擊產生保護。

因此，進一步的，本發明還提出了一種輪狀病毒疫苗，其特征在于其有效成分為本發明所述的具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株或其傳代株，抑或是所述具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株的滅活抗原。

其中，優選的，所述的傳代株是HRV-LZ-2013減毒株在Vero細胞上連續傳代20-100代所獲得的減毒株。

更進一步的，本發明還提供了一種制備輪狀病毒減毒活疫苗以及滅活疫苗的方法。

其中，一種制備輪狀病毒減毒活疫苗的方法，其特征包括以下步驟：

(1)病毒的增殖培養