[發(fā)明專利]具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株以及由該減毒株制備得到的疫苗

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410498365.1
• 申請日: 2014-09-25
• 公開（公告）號: CN104312985A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發(fā)明（設計）人: 呂宏亮;張澍
• 申請（專利權）人: 呂宏亮;張澍
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N7/06;A61K39/15;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

1.具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株，命名為HRV-LZ-2013，基因分型為G10P8，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為：CGMCC?No.9452。

2.權利要求1所述的具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株在制備輪狀病毒疫苗中的應用。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的輪狀病毒疫苗為輪狀病毒減毒活疫苗或滅活疫苗。

4.一種輪狀病毒疫苗，其特征在于其有效成分為權利要求1所述的具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株或其傳代株，抑或是權利要求1所述的具有廣譜免疫原性的人源輪狀病毒減毒株的滅活抗原。

5.如權利要求4所述的輪狀病毒疫苗，其特征在于所述的傳代株是HRV-LZ-2013減毒株在Vero細胞上連續(xù)傳代20-100代所獲得的減毒株。

6.一種制備輪狀病毒減毒活疫苗的方法，其特征包括以下步驟：

(1)病毒的增殖培養(yǎng)

Vero細胞按20-30萬個/ml接種轉瓶，37℃培養(yǎng)3天后，將輪狀病毒HRV-LZ-2013或其傳代株按MOI?0.01-0.1接種，37℃培養(yǎng)1小時后，生理鹽水洗后加入病毒維持液，所述病毒維持液為含0.1％的牛血清的MEM，pH?7.2，32℃培養(yǎng)3-5天，反復凍融3次，離心除去細胞碎片，采用MA104細胞測定病毒滴度，滴度≥5.5logCCID₅₀/ml且無菌為合格疫苗原液；

(2)輪狀病毒HRV-LZ-2013的純化

采用連續(xù)蔗糖密度梯度離心法，在含有60％蔗糖的TNE緩沖液中120000g離心10小時，取出浮力密度為1.36g/ml的純化原液，電鏡觀察合格后重懸稀釋到PH＝7.0含10％山梨糖的Hanks平衡液中；

(3)加入適宜抗動物胃酸的輪狀病毒保護劑，制成液體或凍干口服劑型。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的傳代株是HRV-LZ-2013減毒株在Vero細胞上連續(xù)傳代20-100代所獲得的減毒株。

8.一種制備輪狀病毒滅活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)病毒的增殖培養(yǎng)

Vero細胞按20-30萬個/ml接種轉瓶，37℃培養(yǎng)3天后，將輪狀病毒HRV-LZ-2013按MOI?0.01-0.1接種，37℃培養(yǎng)1小時后，生理鹽水洗后加入病毒維持液，所述病毒維持液為含0.1％的牛血清的MEM，pH?7.2，32℃培養(yǎng)3-5天，反復凍融3次，離心除去細胞碎片，采用MA104細胞測定病毒滴度，滴度≥5.5logCCID₅₀/ml且無菌為合格疫苗原液；

(2)輪狀病毒HRV-LZ-2013的純化

采用連續(xù)蔗糖密度梯度離心法，在含有60％蔗糖的TNE緩沖液中120000g離心10小時，取出浮力密度為1.36g/ml的純化原液，電鏡觀察合格后重懸稀釋到PH＝7.0含10％山梨糖的Hanks平衡液中；

(3)病毒的滅活

輪狀病毒HRV-LZ-2013分別經(jīng)1/4000甲醛在室溫滅活7天，1/4000β-丙內脂室溫滅活16小時，37℃水解1小時，55℃水浴滅活2小時，取樣進行電鏡觀察和殘余活病毒培養(yǎng)檢測；

(4)合格滅活的輪狀病毒抗原經(jīng)0.45μM的膜除菌過濾并檢測熱原后加入貯存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>

(5)制備滅活疫苗

純化滅活后的病毒抗原采用水包油或油包水佐劑乳化制成含50-100μg/ml病毒抗原的疫苗。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述的合格滅活的輪狀病毒抗原是指三層外殼蛋白完整的輪狀病毒≥90％且無殘余病毒活性的抗原，輪狀病毒殘余毒力試驗采用Vero細胞連續(xù)培養(yǎng)3個代次無任何細胞病變，經(jīng)熱滅活的輪狀病毒結構完整，在SDS?PAGE電泳上有5種蛋白VP1、VP2、VP4、VP6、VP7顯示。

10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的佐劑包括MF59、AS04、Al(OH)₃佐劑。