[發明專利]一種特異性定量檢測口蹄疫O型廣西株抗原的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410496158.2
• 申請日: 2014-09-25
• 公開（公告）號: CN105445462B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發明（設計）人: 劉國英;鄭金來;吳園園;任旭榮;范秀麗;蒼楓;劉飛
• 申請（專利權）人: 金宇保靈生物藥品有限公司;北京三聯博悅生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531;G01N33/543;G01N21/31
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司11322
• 代理人: 魯兵

技術領域

本發明屬于酶聯免疫檢測分析技術領域，具體涉及一種特異性定量測定口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)抗原的酶聯免疫試劑盒，適用于口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)抗原的特異、快速、準確檢測分析。

背景技術

口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus，FMDV)屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，該病毒有7個血清型，各型之間無交叉保護反應。目前國內主要流行的是O型、亞洲1型(如JSL/06株)和A型(A/WH/09株)。其中，O型包括多個毒株，分別是新疆株(O/Mya98/XJ/2010株)、佳木斯株(O/JMS/2000株)、緬甸98株(O/Mya98/BY/2010株)、OZK株(OZK/93株)等。廣西株(O/GX/09-7株)也是O型中的一種，在國內廣泛流行。快速、準確、特異的檢測口蹄疫O型廣西株抗原(O/GX/09-7株)有助于疾病的診斷以及疫苗生產質量控制。

目前，測定口蹄疫抗原146S的方法主要有密度梯度離心法。但是，密度梯度離心法操作復雜，需要3天的時間，且每臺超速離心機每次只能檢測5份樣品，同時不能進行血清型的區分。目前，國內口蹄疫疫苗大多為多價苗，這意味著該疫苗中含有多種毒株或血清型，比如金宇保靈生物藥品有限公司生產的豬口蹄疫O型滅活疫苗含有2種O型抗原，分別是新疆株(O/Mya98/Xj/2010株)和廣西株(O/GX/09-7株)。每種抗原的準確定量是保證疫苗安全、有效的一個重要手段。現有密度梯度離心法無法區分不同的口蹄疫血清型，更不能區分同一血清型的不同毒株。從而，需要人們尋找一種更為特異、靈敏和可靠的檢測分析方法能夠有效區分不同的血清型和毒株。

免疫測定(Immunoassay)于上個世紀70年代問世，是通過利用特異性強的抗原抗體反應發展起來的一項具有高靈敏度、高特異性并且快速的分析方法。目前，市場上主流的免疫測定技術主要包括酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)和化學發光免疫分析(chemiluminescentimmunoassay，CLIA))以及膠體金免疫紙層析等。目前，這些方法已經被廣泛應用于臨床檢測，包括傳染病、腫瘤以及激素等項目上。ELISA技術的靈敏度通常可達到ng/mL甚至pg/mL的水平，一般可在30分鐘至2小時內完成對近百份樣品的檢測，且不需要特殊的儀器設備，完全可以滿足口蹄疫146S抗原檢測的需要。目前，市場上偶見能夠檢測口蹄疫抗原的酶聯免疫檢測試劑盒，但是大都采用了多克隆抗體制成，比如中國農業科學院蘭州獸醫研究所開發、生產的O型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒，該試劑盒已經申報專利(專利號CN103076451A)，專利宣稱這個試劑盒采用了O型口蹄疫的兔抗血清和豚鼠抗血清兩種多克隆抗體制成，能夠將O型與A型、亞洲1型區分開，但是無法區分O型的不同毒株，比如金宇保靈生物藥品有限公司生產的豬口蹄疫O型滅活疫苗中的新疆株(O/Mya98/XJ/2010株)和廣西株(O/GX/09-7株)，因而就無法對該疫苗中的每種口蹄疫146S抗原進行單獨定量，其主要的原因就在于多克隆抗體針對多種抗原表位，而不同的血清型尤其是同一血清型的不同毒株之間可能會存在相同的抗原表位。

1975年，分子生物學家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術的基礎上創建了單克隆抗體制備技術(雜交瘤技術)，通過這種技術可以獲得針對某特定抗原表位的抗體，并大量制備。時至今日，該技術已經非常成熟，并在不同的領域得到廣泛的應用。由于不同血清型的口蹄疫146S抗原的基因序列同源性較高，尤其是同一血清型不同毒株間的同源性非常之高，同源性可超過85％，可能只有少數幾個或者幾十個氨基酸序列的差異。因此，用病毒直接免疫制備單克隆抗體，并從中篩選獲得針對特定血清型、尤其是同一血清型不同毒株的特異性抗體就變得非常困難。因此，如何快速、準確地找到口蹄疫病毒不同血清型、不同毒株之間有差別的抗原表位(蛋白或者多肽)，并以此制備特異性單克隆抗體成為開發區分不同血清型、甚至區分同一血清型的不同毒株的口蹄疫146S抗原ELISA試劑盒首要解決的問題。

發明內容

首先，本發明提供了一種特異性的口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)抗原酶聯免疫定量測定試劑盒。

本發明所提供的試劑盒，包括用口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)的一株特異性單克隆抗體作為捕獲抗體制成的包被酶標板。