[發明專利]一種特異性定量檢測口蹄疫O型廣西株抗原的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201410496158.2
• 申請日: 2014-09-25
• 公開（公告）號: CN105445462B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發明（設計）人: 劉國英;鄭金來;吳園園;任旭榮;范秀麗;蒼楓;劉飛
• 申請（專利權）人: 金宇保靈生物藥品有限公司;北京三聯博悅生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531;G01N33/543;G01N21/31
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司11322
• 代理人: 魯兵

1.一種特異性定量測定口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)的酶聯免疫試劑盒，包括口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)的一株特異性單克隆抗體作為捕獲抗體制成的包被酶標板。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括用口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)146S抗原另外一株特異性單克隆抗體作為檢測抗體經酶標記制成的酶標記抗體；所述標記酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶等，優選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或過碘酸法交聯在抗體上。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)的陽性質控品，可選擇各疫苗廠生產的口蹄疫O型廣西株

(O/GX/09-7株)146S抗原純化滅活液，優選的是金宇保靈生物藥品有限公司生產的口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)146S抗原純化滅活液；所述陽性質控品的原料為標準級，純度不低于80％，使用時稀釋至8-64ng/mL。

4.根據權利要求1或2或3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還可包括檢測用的樣品稀釋液、洗滌液、顯色底物液、終止液及說明書；

所述樣品稀釋液的配方為：Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，NaH₂PO₄·2H₂O0.296g，NaCl8.5g，Proclin3000.6mL，酪蛋白10g，新生牛血清50mL，用雙蒸水定溶至1000mL，調整pH值至7.2-7.4；

所述洗滌液的配方為：Na₂HPO₄·12H₂O58g，NaH₂PO₄·2H₂O5.92g，NaCl170g，Tween-201.0mL，Proclin3000.6mL，用雙蒸水定溶至1000mL，調整pH值至7.2-7.4；使用洗滌液前用雙蒸水稀釋20倍；

所述顯色底物液的配方為：

1)辣根過氧化物酶(HRP)的顯色底物液包含A液和B液，其中，顯色底物A液的配方為：三水合乙酸鈉8.2g、冰醋酸1.2mL、濃度為30％的過氧化氫0.27mL，用雙蒸水定溶至1000mL，調整pH值至5.0-5.6；

顯色底物B液的配方為：檸檬酸1.92g，乙二胺四乙酸鈉0.372g，10mol/L氫氧化鈉溶液0.3mL，甘油50mL，四甲基聯苯胺鹽酸鹽0.23g，用雙蒸水定溶至1000mL，調整pH值至2.5-3.5；

使用前將A液與B液按1：1比例混合；

2)堿性磷酸酶(ALP)的顯色底物液配方為：pNPP1g，二乙醇胺100mL，無水氯化鎂47.5mg，雙蒸水900mL，pH9.8；

所述終止液的配方為：辣根過氧化物酶的終止液為：1000mL雙蒸水中含有濃度為98％的硫酸27.8mL；堿性磷酸酶的終止液為：1000mL雙蒸水中含有53g的碳酸鈉。

5.根據權利要求1-4任一所述的試劑盒，其特征在于：口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)的特異性單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

1)通過2-DE電泳獲得口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)特異性抗原片段的特異性蛋白條帶，分子量大約在20-30KDa，優選其中5個豐度比較高的蛋白條帶干燥、研碎后作為免疫原使用；

2)用口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)特異性抗原片段作為免疫原免疫動物；連續免疫4次，每次間隔14天，前3次采用多點皮下免疫方式，第4次采取腹腔注射的免疫方式，每次10μg/只動物；

3)分離免疫動物的脾細胞，將其與骨髓瘤細胞融合，用HAT選擇性培養基篩選雜交瘤細胞，對雜交瘤細胞上清用間接ELISA方法篩選特異性陽性克隆；

4)培養雜交瘤細胞；從細胞培養液或接種雜交瘤細胞動物的腹水液中分離并純化出口蹄疫O型廣西株(O/GX/09-7株)的特異性單克隆抗體。