[發(fā)明專利]一種從痰液中提取核酸的試劑盒及提取方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410492307.8
• 申請日: 2014-09-23
• 公開（公告）號: CN104232621A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邱英華;周細(xì)武;唐濤
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波有成生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域中核酸(DNA和RNA)的提取方法，具體涉及一種從人類痰液中提取核酸的方法及其應(yīng)用。

技術(shù)背景

肺癌(lung?cancer)是一種常見的嚴(yán)重威脅我國人民健康的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，我國每年死于肺癌的患者達(dá)60萬人，且以每年25％的速度增長，其死亡率及發(fā)病率在我國的幾大城市位高居首位(范振符，陳志周，范飛舟.糖基化改變與腫瘤的基礎(chǔ)研究[J].標(biāo)記免疫分析與臨床.2012,27(3):122-314)。在肺癌病人中，高達(dá)三分之二的病例在確診時已是晚期階段(Spiro?SG,Silvestri?GA.The?treatment?of?advanced?non-small?cell?Jung?cancer[J].Curr?Opin?Pulm?Med,2005,11:287-291)。雖然肺癌的早期診斷率只有15％，但這些患者的5年生存率可達(dá)60％～90％。因此，對高危、疑似肺癌人群進(jìn)行早期診斷，是降低肺癌死亡率的重要途徑。

纖維支氣管鏡、經(jīng)皮肺活檢、手術(shù)是肺癌確診的主要手段，但這些手段系創(chuàng)傷性、花費大，且具有一定的并發(fā)癥，不適合用于肺癌的早期篩查。痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查在過去30年里長期用于肺癌早期普查和診斷，與CT和支氣管內(nèi)鏡檢查相比，其標(biāo)本取材方便、簡單易行、費用低、無損傷。通過31290例痰標(biāo)本細(xì)胞病理學(xué)檢驗結(jié)果,與CT、MRI、X線、氣管鏡、肺穿、手術(shù)結(jié)果對照,肺癌痰脫落細(xì)胞檢查陽性率達(dá)到90.4％(王玲,王永才，趙成艷.肺癌痰脫落細(xì)胞檢查診斷價值[J]中國醫(yī)療前沿,2008,3(16),92-93)。然而痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查存在如下缺點：需使用新鮮痰液，且選擇其中帶有特征性的部分進(jìn)行檢查；腫瘤細(xì)胞具有其特定的發(fā)育演變過程及形態(tài)特征,有些病例常常是在未見到典型的腫瘤細(xì)胞前而出現(xiàn)不正常細(xì)胞的形態(tài)變異，在判斷是否為腫瘤細(xì)胞時需要依靠檢驗醫(yī)師的業(yè)務(wù)水平、謹(jǐn)慎程度和責(zé)任心，存在主觀因素。

尋找一種有效、安全、無創(chuàng)的輔助診斷手段以提高肺癌的早期臨床診斷率是臨床所迫切需要的。惡性腫瘤細(xì)胞的DNA含量異常是其基本生物學(xué)特征之一，它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展上具重要意義。研究表明，在肺癌的早期階段，部分基因的表達(dá)出現(xiàn)了異常，例如KRAS、P53等，采用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)分析檢測病人痰液中的DNA，分析其中的異常情況，可為肺癌的早期診斷提供強有力的參考，必將會提高肺癌的發(fā)現(xiàn)率，對病人的臨床診斷和治療具有積極的意義。

由于痰液中有大量黏液，使其中的細(xì)胞成分不易分離，高純度及較大量的DNA提取存在著一定困難。發(fā)明人采用了高效的痰液液化方法，在不破壞核酸的情況下對痰液進(jìn)行液化處理，再采用蛋白酶消化痰液中的粘蛋白后，用離心柱法提取痰液中的核酸。采用本方法提取得到的痰液DNA純度高、質(zhì)量穩(wěn)定，適用于分子生物學(xué)檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服實驗室現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠從痰液中提取核酸的專用試劑盒及提取方法。

本發(fā)明提供的提取痰液核酸試劑盒所含試劑及耗材見表1，提取流程為：在痰液中加入1～10倍量的消化液KB，震蕩混合均勻，加入蛋白酶于37～65℃保溫1～5小時后，加入痰液樣本量0.5～3倍量的結(jié)合液BS，震蕩混合均勻后將溶液全部通過核酸吸附柱，樣品中的核酸將結(jié)合到吸附柱的硅膠膜上。用洗滌液SWB1和SWB2分別洗滌吸附柱后，再用洗脫液將核酸從吸附柱上洗脫下來。

表1：痰液核酸提取試劑盒所含試劑及耗材

本發(fā)明的發(fā)明人以臨床收集的痰液為樣品，進(jìn)行了大量的對比、優(yōu)化實驗，優(yōu)選出提取痰液核酸的最適操作步驟及相應(yīng)溶液的最佳配方。

消化液KB的成分包括但不限于SDS、EDTA、吐溫20、DTT、Tris-HCl，在配方中的濃度見表2。

表2：消化液KB的配方

在消化液KB中，SDS的濃度為0.25g/L～0.95g/L，最適濃度為0.55g/L～0.75g/L；EDTA的濃度為0.05mmol/L～1.5mmol/L，最適濃度為0.06mmol/L～0.09mmol/L；吐溫20的濃度為0.1％～6％，最適濃度為2.5％～3％；DTT的濃度為20mmol/L～100mmol/L，最適濃度為60mmol/L～85mmol/L；Tris-HCl濃度為20mmol/L～100mmol/L，最適濃度為50mmol/L～85mmol/L，最適pH為8.0～8.8。