[發明專利]c?Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統及篩選方法

有效

• 申請號: 201410491980.X
• 申請日: 2014-09-24
• 公開（公告）號: CN104458681B
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 孫毅毅;謝興亮;鐘玲;林東
• 申請（專利權）人: 成都醫學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙)51222
• 代理人: 李高峽,張娟

1.一種c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統，其特征在于：包括c-Cbl蛋白、熒光分子標記的ZAP-70蛋白、熒光分子標記的泛素-UbCH7蛋白，三者的摩爾比為（0.4μM ~2μM）：（0.4μM ~2μM）：（20nM ~40μM）；

所述熒光分子標記的ZAP-70蛋白為銪熒光標記的ZAP-70蛋白；所述銪熒光標記的ZAP-70蛋白按照如下方法制備：將抗-GST-Eu³⁺-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比為（2~6）：1的比例混合，在室溫下孵育10~30分鐘，即可；

所述熒光分子標記的泛素-UbCH7蛋白為別藻藍熒光蛋白(APC)標記的生物素-泛素-UbCH7蛋白；所述別藻藍熒光蛋白標記的生物素-泛素-UbCH7蛋白按照如下方法制備：將抗-Biotin-APC抗體與Biotin-Ub-UbCH7蛋白，以摩爾比為（10~30）：1的比例混合，在室溫下孵育10~30分鐘。

2.根據權利要求1所述的篩選系統，其特征在于：所述抗-GST-Eu³⁺-抗體與GST-ZAP70蛋白的摩爾比為4:1，孵育時間為20min。

3.根據權利要求1所述的篩選系統，其特征在于：抗-Biotin-APC抗體與Biotin-Ub-UbCH7蛋白的摩爾比為20:1，孵育時間為20min。

4.一種c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）取ZAP-70蛋白和泛素-UbCH7蛋白，分別用熒光標記，得熒光分子標記的ZAP-70蛋白、熒光分子標記的泛素-UbCH7蛋白，混合，得混合溶液；

（2）取待測樣品，加入c-Cbl蛋白溶液，再加入步驟（1）所得混合溶液混合，測定熒光值；

（3）根據熒光值，判斷待測化合物是否為c-Cbl蛋白泛素化抑制劑；

步驟（1）中，所述熒光分子標記的ZAP-70蛋白為銪熒光標記的ZAP-70蛋白；所述銪熒光標記的ZAP-70蛋白按照如下方法制備：將抗-GST-Eu³⁺-抗體與GST-ZAP70蛋白以摩爾比為（2~6）：1的比例混合，在室溫下孵育10~30分鐘，即可；

步驟（1）中，所述熒光分子標記的泛素-UbCH7蛋白為別藻藍熒光蛋白(APC)標記的生物素-泛素-UbCH7蛋白；

所述別藻藍熒光蛋白(APC)標記的生物素-泛素-UbCH7蛋白按照如下方法制備：將抗-Biotin-APC抗體與Biotin-Ub-UbCH7蛋白，以摩爾比為（10~30）：1的比例混合，在室溫下孵育10~30分鐘；

步驟（1）中，所述混合溶液中，熒光分子標記泛素-UbCH7蛋白的終濃度為0.4 μM~ 2 μM；熒光分子標記的ZAP-70蛋白的濃度為20 nM ~ 40 nM；

步驟（2）中，所述待測樣品的濃度為5μM ~15μM；

步驟（2）中，所述c-Cbl蛋白的濃度為0.4 μM ~ 2 μM。

5.根據權利要求4所述的篩選方法，其特征在于：所述抗-GST-Eu³⁺-抗體與GST-ZAP70蛋白的摩爾比為4:1，孵育時間為20min。

6.根據權利要求4所述的篩選方法，其特征在于：抗-Biotin-APC抗體與Biotin-Ub-UbCH7蛋白的摩爾比為20:1，孵育時間為20min。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（2）中，所述待測樣品、c-Cbl蛋白溶液和混合溶液的體積比為（0.5~1.5）:（1.5~2.5）: （1.5~2.5）。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述待測樣品、c-Cbl蛋白溶液和混合溶液的體積比為1:2:2。