[發明專利]c?Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統及篩選方法

有效

• 申請號: 201410491980.X
• 申請日: 2014-09-24
• 公開（公告）號: CN104458681B
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 孫毅毅;謝興亮;鐘玲;林東
• 申請（專利權）人: 成都醫學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙)51222
• 代理人: 李高峽,張娟

技術領域

本發明涉及c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統和篩選方法。

背景技術

Cbl(Casitas B-lineage lymphoma)蛋白是一類在生物體內廣泛分布的細胞內蛋白，屬于泛素連接酶E3系。c-Cbl在細胞內廣泛表達，但主要存在于細胞質中。c-Cbl由N-端高度保守的酪氨酸激酶結合功能域(Tyrosine kinase binding domain，TKB)、環狀功能域(RING)、富含脯氨酸功能域、C-端與泛素結合(Ubiquitin-associated，UBA)的功能域及與之重疊的亮氨酸拉鏈功能域組成。c-Cbl分子中的TKB及其他功能域可以識別并結合靶蛋白，RING功能域負責募集泛素結合酶E2，從而啟動泛素化降解途徑。c-Cbl通過調控信號蛋白參與細胞內信號轉導的負向調控，這對于維持細胞的內穩態具有重要作用。

2型糖尿病(舊稱非胰島素依賴型糖尿病或成人糖尿病)，是一種嚴重的代謝性疾病，患者的主要特征為胰島素抵抗、相對胰島素缺乏和高血糖，常需要給予藥物或胰島素治療，但也可通過增加體育運動和膳食控制病情。在發達國家，近年來2型糖尿病患者數迅速增加，美國疾病控制和預防中心已將2型糖尿病歸入流行病之一。2型糖尿病過去在40歲以上的成年人中發病，而今越來越多的未成年人也身患此病，其原因可能是由于該年齡段的高肥胖率所致，2型糖尿病常與肥胖、高血壓、高膽固醇(混合型高血脂癥)以及“代謝綜合征”(又稱X綜合癥、Reavan's綜合征、CHAOS綜合癥)相關，同時也與肢端肥大、柯興氏綜合征以及許多其他內分泌疾病相關。2型糖尿病復雜且多因素的代謝改變常導致多個器官的損傷和功能損害，其中最重要的累及部位即是心血管系統，導致患者心血管疾病發病率和死亡率顯著上升，因此2型糖尿病已成為當前嚴重的世界性問題并引起了眾多醫生以及科研人員的關注，特別是對胰島素的敏感度降低以及糖脂代謝的研究更是目前國際關注的熱點之一。在過去的幾十年里，一系列調控食欲、食物吸收以及增加肌肉組織或脂肪組織能量消耗的基因陸續被發現，其中c-Cbl基因就參與了全身能量消耗的調控。2004年Cooney GJ研究發現，c-Cbl在調控全身能量平衡中起著重要的作用。2006年，該組進一步發現證明c-Cbl通過調節胰島素敏感度參與了全身能量平衡的調控以及c-Cbl泛素連接酶E3功能域參與了身體能量平衡的調控。

綜上，c-Cbl蛋白功能域參與了機體能量平衡的調控，是潛在的治療代謝性相關疾病的藥物靶點，然而目前對c-Cbl蛋白抑制劑的研究尚為空白。如果我們能成功篩選出抑制c-Cbl蛋白的抑制劑，那么通過抑制c-Cbl蛋白對身體能量平衡的調控，將可以增加機體氧氣消耗量，胰島素敏感度以及能量消耗量，從而有效降低體重以及調控其機體能量平衡，同時本研究將有助于鑒定和確證c-Cbl蛋白作為新的藥物靶點的可能性，有助于闡明c-Cbl的某些病理生理學意義，對于治療糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病的新型藥物研發以及為靶向c-Cbl蛋白的藥物研發提供科學依據和實踐指導。

基于熒光共振能量轉移的檢測技術是近年來被應用于藥物高通量篩選(HTS)的重要方法之一。熒光共振能量轉移是指兩個熒光發色基團在足夠靠近時，當供體分子吸收一定頻率的光子后被激發到更高的電子能態，在該電子回到基態前，通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移(即發生能量共振轉移，FRET)。FRET是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發態能量轉移到受體激發態的過程，使供體熒光強度降低，而受體可以發射更強于本身的特征熒光(敏化熒光)，也可以不發熒光(熒光猝滅)，同時也伴隨著熒光壽命的相應縮短或延長。能量轉移的效率和供體的發射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等因素有關。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統和篩選方法。

本發明c-Cbl蛋白泛素化抑制劑的高通量篩選系統，包括c-Cbl蛋白、熒光分子標記的ZAP-70蛋白、熒光分子標記泛素-UbCH7蛋白，三者的摩爾比為(0.4μM～2μM)：(0.4μM～2μM)：(20nM～40μM)。

ZAP-70蛋白：ξ鏈連接蛋白(Zap-70)。

UbCH7蛋白：泛素連接酶蛋白。

所述熒光分子標記的ZAP-70蛋白為銪熒光標記的ZAP-70蛋白。