[發(fā)明專利]卵巢組織深低溫保存方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410488221.8
• 申請日: 2014-09-22
• 公開（公告）號: CN104222071A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖準(zhǔn)
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京超凡志成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及卵巢組織深低溫保存方法。

背景技術(shù)

近年來，惡性腫瘤呈現(xiàn)出發(fā)病率增加和低齡化趨勢，隨著早期診斷以及放、化療手段的進步，多種惡性腫瘤治愈率可達(dá)90％以上。但兒童期、青春期以及育齡期女性接受大劑量聯(lián)合化療和放療后，其性腺毒性可能會導(dǎo)致卵巢早衰和生育力喪失，極大降低了治療后長期生存的女性患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重影響其社會家庭角色。因此，女性生育力保護和保存已成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟需解決的重大課題。在女性生育力保存中，卵巢組織深低溫保存是最有潛力和最受關(guān)注的技術(shù)之一，已成為近年生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。

程序化慢速冷凍法是目前卵巢組織深低溫保存的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法通常將卵巢組織在3-5℃下置于含有冷凍保護劑的溶液中預(yù)平衡，使冷凍保護劑充分滲透卵巢組織后，再放入含冷凍保護劑的冷凍管中，在相應(yīng)的冷凍設(shè)備中按設(shè)定冷凍程序冷凍。其中，Gosden提出的二甲亞砜(DMSO)冷凍方案和Gook推薦的丙二醇(PROH)冷凍方案，是目前應(yīng)用最多，效果較為理想的冷凍方案。

在Gosden提出的方案中，冷凍保護劑采用1.5M?DMSO+0.1M蔗糖的程序化冷凍保護液；Gook推薦的PROH冷凍方案中使用含有1.5M?PROH+0.1M蔗糖的程序化冷凍保護液。在上述的兩種方案中，待保存的卵巢組織均需要加入到冷凍保護劑(液)中預(yù)平衡30-90分鐘；然后再利用相應(yīng)的冷凍設(shè)備進行深低溫冷凍保存。

在相關(guān)技術(shù)中，由于卵巢組織結(jié)構(gòu)致密，在冷凍中，為了使冷凍保護劑在卵巢組織的中心也能達(dá)到理想濃度，則必須延長卵巢組織在冷凍保護劑中的平衡時間，使保護劑充分滲透(目前通常將卵巢組織置于冷凍保護劑中平衡30-90分鐘)。雖然冷凍保護劑在避免人卵巢組織冷凍過程中的冷凍損傷發(fā)揮重要作用，但其自身也存在組織細(xì)胞毒性，在預(yù)平衡的過程中，卵巢組織長時間(30-90分鐘)地置于冷凍保護劑中，由于平衡的時間過長，冷凍保護劑往往會使卵巢組織受到細(xì)胞毒性損傷，影響冷凍效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種卵巢組織深低溫保存方法，以解決卵巢組織在預(yù)平衡的過程中易被冷凍保護劑的細(xì)胞毒性造成損傷的技術(shù)問題。

在本發(fā)明的實施例中提供了卵巢組織深低溫保存方法，包括以下步驟：

將待冷凍的卵巢組織用體積濃度為8-12％的透明質(zhì)酸酶溶液在室溫下培養(yǎng)10-15分鐘，得到酶解后卵巢組織；

將所述酶解后卵巢組織加入到冷凍保護劑中，在3-5℃預(yù)平衡10-15分鐘，得到預(yù)平衡后卵巢組織；

將所述預(yù)平衡后卵巢組織進行程序化冷凍，使其溫度降至-150℃后，轉(zhuǎn)入液氮罐進行儲存。

本發(fā)明提供的這種卵巢組織深低溫保存方法，在將待冷凍的卵巢組織進行預(yù)平衡之前，利用透明質(zhì)酸酶溶液(體積濃度為8-12％)在室溫下培養(yǎng)處理。卵巢組織由于含有大量的膠原結(jié)締組織，使其本身具備結(jié)構(gòu)致密的特性，而通過既定體積濃度的透明質(zhì)酸酶溶液對其進行室溫培養(yǎng)的操作，實現(xiàn)了透明質(zhì)酸酶對膠原等組織進行酶解的效果，使致密的卵巢組織間質(zhì)疏松，進而利于后續(xù)預(yù)平衡過程中冷凍保護劑的順利滲透；為縮短后續(xù)在冷凍保護劑中的平衡時間奠定基礎(chǔ)。通過酶解處理之后，在預(yù)平衡的過程中，僅用10-15分鐘即可達(dá)到預(yù)平衡效果(冷凍保護劑滲透到卵巢組織中心)；與現(xiàn)有技術(shù)中常見的30-90分鐘的預(yù)平衡時間相比，大幅縮短了預(yù)平衡的時間，避免了由于預(yù)平衡時間過長，進而導(dǎo)致其冷凍保護劑對卵巢組織的細(xì)胞毒性損傷。

可選的，在所述步驟將待冷凍的卵巢組織用體積濃度為8-12％的透明質(zhì)酸酶溶液在室溫下培養(yǎng)10-15分鐘，得到酶解后卵巢組織之前，還包括：

收集卵巢組織，并將其置于含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)液；

將加入有卵巢組織的L-15培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至冰盒，在8-12分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)到無菌超凈工作臺內(nèi)，更換新鮮的含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)液；

剪除所述卵巢組織的卵巢髓質(zhì)，并將去除卵巢髓質(zhì)的卵巢皮質(zhì)剪成厚度為1-2毫米、面積為2-3平方毫米的塊狀，得到待冷凍的卵巢組織。

可選的，在所述步驟將待冷凍的卵巢組織用體積濃度為8-12％的透明質(zhì)酸酶溶液在室溫下培養(yǎng)10-15分鐘，得到酶解后卵巢組織；

在所述透明質(zhì)酸酶溶液中，按照體積份數(shù)計，包括0.8-1.2份透明質(zhì)酸酶和8.8-9.2份含10％胎牛血清的L-15培養(yǎng)液。

可選的，在所述步驟將所述酶解后卵巢組織加入到冷凍保護劑中，在3-5℃預(yù)平衡10-15分鐘，得到預(yù)平衡后卵巢組織中；