[發明專利]卵巢組織深低溫保存方法

有效

• 申請號: 201410488221.8
• 申請日: 2014-09-22
• 公開（公告）號: CN104222071A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 肖準
• 申請（專利權）人: 四川大學華西第二醫院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

1.一種卵巢組織深低溫保存方法，其特征在于，包括以下步驟：

將待冷凍的卵巢組織用體積濃度為8-12％的透明質酸酶溶液在室溫下培養10-15分鐘，得到酶解后卵巢組織；

將所述酶解后卵巢組織加入到冷凍保護劑中，在3-5℃預平衡10-15分鐘，得到預平衡后卵巢組織；

將所述預平衡后卵巢組織進行程序化冷凍，使其溫度降至-150℃后，轉入液氮罐進行儲存。

2.根據權利要求1所述的卵巢組織深低溫保存方法，其特征在于，在所述步驟將待冷凍的卵巢組織用體積濃度為8-12％的透明質酸酶溶液在室溫下培養10-15分鐘，得到酶解后卵巢組織之前，還包括：

收集卵巢組織，并將其置于含10％胎牛血清的L-15培養液；

將加入有卵巢組織的L-15培養液轉至冰盒，在8-12分鐘內轉到無菌超凈工作臺內，更換新鮮的含10％胎牛血清的L-15培養液；

剪除所述卵巢組織的卵巢髓質，并將去除卵巢髓質的卵巢皮質剪成厚度為1-2毫米、面積為2-3平方毫米的塊狀，得到待冷凍的卵巢組織。

3.一種根據權利要求2所述的卵巢組織深低溫保存方法，其特征在于，在所述步驟將待冷凍的卵巢組織用體積濃度為8-12％的透明質酸酶溶液在室溫下培養10-15分鐘，得到酶解后卵巢組織中；

在所述透明質酸酶溶液中，按照體積份數計，包括0.8-1.2份透明質酸酶和8.8-9.2份含10％胎牛血清的L-15培養液。

4.根據權利要求3所述的卵巢組織深低溫保存方法，其特征在于，在所述步驟將所述酶解后卵巢組織加入到冷凍保護劑中，在3-5℃預平衡10-15分鐘，得到預平衡后卵巢組織中；

所述冷凍保護劑由二甲基亞砜和蔗糖組成；且在所述冷凍保護劑中，所述二甲基亞砜和所述蔗糖的濃度分別為1摩爾每升和0.1摩爾每升。

5.根據權利要求4所述的卵巢組織深低溫保存方法，其特征在于，在所述步驟將所述酶解后卵巢組織加入到冷凍保護劑中，在3-5℃預平衡10-15分鐘，得到預平衡后卵巢組織中，具體包括：

在每1毫升所述冷凍保護劑中加入2-3片酶解后的所述卵巢組織，并在4℃預平衡15分鐘，得到預平衡后卵巢組織。

6.根據權利要求1-5任一項所述的卵巢組織深低溫保存方法，其特征在于，在所述步驟將所述預平衡后卵巢組織進行程序化冷凍，使其溫度降至-150℃后，轉入液氮罐進行儲存中；

所述程序化冷凍利用程序冷凍儀完成。

7.根據權利要求6所述的卵巢組織深低溫保存方法，其特征在于，在所述步驟將所述預平衡后卵巢組織進行程序化冷凍，使其溫度降至-150℃后，轉入液氮罐進行儲存中，具體包括：

將裝有預平衡后卵巢組織的冷凍管放入程序冷凍儀中，開始冷凍溫度為4℃，以-2℃/min的降溫速率降至-7℃，維持5分鐘；

將浸過液氮的鑷子夾在冷凍管外壁含有卵巢組織的保護液與空氣的交界面，人工植冰，誘導產生冰晶，并維持10分鐘；再以-0.3℃/min的降溫速率降至-40℃；最后以-30℃/min的降溫速率降至-150℃；將整個冷凍管轉移至液氮罐進行儲存。