[發明專利]一種臨床用間充質干細胞的制備方法

在審

• 申請號: 201410487187.2
• 申請日: 2014-09-22
• 公開（公告）號: CN104212764A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 董成友;朱兵銳;江曄;謝天
• 申請（專利權）人: 上海華顏干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中;陳少凌

技術領域

本發明屬細胞生物學領域，具體涉及一種臨床用間充質干細胞的制備方法。

背景技術

干細胞(Stem?Cells，SC)是一類具有自我復制能力(self-renewing)的多潛能細胞，是原始且未特化的細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能。干細胞存在所有多細胞組織里，能經由有絲分裂與分化來分裂成多種的特化細胞，而且可以利用自我更新來提供更多干細胞。干細胞的來源有很多，包括臍帶、臍帶血與骨髓。

嬰兒出生后遺留在胎盤和臍帶中的血是干細胞的重要來源。臍帶血中的造血干細胞可以用來治療多種血液系統疾病和免疫系統疾病，包括血液系統惡性腫瘤(如：急性白血病、慢性白血病、多發性骨髓瘤、骨髓異常增殖綜合癥和淋巴瘤等)、血紅蛋白病(如：海洋性貧血)、骨髓造血功能衰竭(如：再生障礙性貧血)、先天性代謝性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患、某些實體腫瘤(如：小細胞肺癌、神經母細胞瘤、卵巢癌和進行性肌營養不良等)。自1988年臍血干細胞就用來治療根達綜合癥、亨達綜合癥、和拉綜合癥和急性淋巴細胞性白血病等許多兒童疾病。截至2011年，臍帶血不僅已能有效地治療幾十種難治性疾病和多種不治之癥，而且它所能治療的疾病種類還在不斷地增加。自體儲存的臍帶血一旦需要使用時，不需配型，細胞活性強，無免疫排斥的危險，移植成活率高，治愈率高，醫療費用低。

在人臍帶中有一類具有干細胞特征的細胞群體，被稱為人間充質干細胞(MSCs)。人間充質干細胞具有自我更新和多向分化的潛能，在不同誘導條件下可分化為三胚層細胞，如骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞和神經細胞等。此外，還表達IL6、G-CSF和SCF等多種造血細胞生長所需要的因子，能夠維持長期培養的造血祖細胞增殖，顯示MSC具有支持造血和促進造血恢復的作用。同時研究表明MSC具有免疫調節作用，在體外能夠抑制T淋巴細胞增殖，體內動物實驗發現MSCs移植可以抑制異體免疫反應，減輕移植相關的排斥反應，并延長異體移植物的存活時間。最近的臨床試驗發現MSCs聯合造血干細胞移植可以減輕GVHD并降低移植失敗率。MSC的多向分化能力和免疫調節能力決定了其在細胞治療、組織工程等領域具有廣闊的應用前景。

目前常規培養間充質干細胞多用動物血清，如雞、豬、牛等，其中胎牛血清因獲取量大、污染輕而被廣泛應用。但近年隨著人畜共患病發病率的增加，以異種血清培養的組織向臨床應用的安全性受到質疑，因此自體血清培養越來越受到重視。

中國發明專利ZL200610067537.5公開了一種臍帶間充質干細胞的制備方法，其步驟包括諸如：將人臍帶去除殘留血液，剪碎，用膠原酶消化；再加入胰酶消化；消化液用篩網過濾，去除未消化組織；將過濾后的消化液用磷酸緩沖液稀釋；離心；以及將細胞接種于培養基內進行培養等。

中國發明專利申請200910194915.X公開了一種臍帶血間充質干細胞及其制備方法，分離并獲取了具有成骨分化潛能的UCB-MSCs細胞亞群的干細胞。其技術手段主要涉及將來自臍血的間充質干細胞的單細胞懸液和熒光標記的CD105單克隆抗體混合后，通過流式細胞儀分選得到CD105陽性(CD105+)的臍帶血間充質干細胞。該干細胞接種于醫學上可接受的生物可降解材料，形成了骨移植物。

但目前公開的各類間充質干細胞制備方法雖均能獲得間充質干細胞，但都不符合臨床應用的標準，本發明擬從原料采集開始直至細胞制備完成的全過程進行臨床級、統一、系統監控，以實現間充質干細胞的臨床標準產品。

發明內容

針對現有技術缺陷，本發明提供一種臨床用間充質干細胞的制備方法，本發明制備方法在臍帶采集前對產婦進行篩選，以符合條件的健康足月產婦志愿者作為采集目標，之后進行分離擴增進行規模化培養直至第三代，進行冷凍保存，對分離過程及冷凍過程的的中間品進行一系列質量檢測，冷凍后細胞復蘇洗滌待用，活率無明顯降低。

本發明提供一種臨床用間充質干細胞的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：

步驟一、臍帶篩選與保存：篩選、采集健康足月產婦志愿者臍帶，置于臍帶保存液中4℃冷藏，并于24小時內進行分離處理；

步驟二、臍帶分離：將臍帶轉移到培養皿中，生理鹽水清洗；去除兩端結扎部位，剝除臍靜脈和兩條臍動脈；展平，撕下華通氏膠，去除羊膜；將撕下的華通氏膠置于離心管中剪碎至1～4mm³小塊；