[發(fā)明專利]一種臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410487187.2
• 申請(qǐng)日: 2014-09-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104212764A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董成友;朱兵銳;江曄;謝天
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海華顏干細(xì)胞科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國(guó)中;陳少凌

1.一種臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

步驟一、臍帶篩選與保存：篩選、采集健康足月產(chǎn)婦志愿者臍帶，置于臍帶保存液中4℃冷藏，并于24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離處理；

步驟二、臍帶分離：將臍帶轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，生理鹽水清洗；去除兩端結(jié)扎部位，剝除臍靜脈和兩條臍動(dòng)脈；展平，撕下華通氏膠，去除羊膜；將撕下的華通氏膠置于離心管中剪碎至1～4mm³小塊；

步驟三、間充質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)：將剪碎的華通氏膠轉(zhuǎn)至裝有完全培養(yǎng)基的透氣蓋培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO₂、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)；細(xì)胞密度達(dá)約1g/T75瓶，第5天首次換液，此后每3天換液一次，至第14天左右；細(xì)胞融合度達(dá)80％以上時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代，用原培養(yǎng)上清終止；

步驟四、傳代培養(yǎng)：傳代時(shí)，傳代細(xì)胞接種密度約為6000個(gè)/cm²；3天后，細(xì)胞密度達(dá)80％以上，再次傳代；傳至第三代，細(xì)胞數(shù)約為3～5×10⁹，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)和活率，按2×10⁷/ml/管進(jìn)行冷凍保存；將細(xì)胞上清進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)，取1×10⁷細(xì)胞做細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)；

步驟五、間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志、分化檢測(cè)：按照ISCT間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)陽(yáng)性指標(biāo)以及陰性指標(biāo)；對(duì)第三代細(xì)胞進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干細(xì)胞分化能力，分別向成脂、成骨、成軟骨三個(gè)方向分化，進(jìn)行油紅O染色、茜素紅染色和阿爾新藍(lán)染色鑒定；間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志、分化檢測(cè)后，冷凍保存；

步驟六、臨床用間干細(xì)胞使用：取冷凍細(xì)胞，復(fù)蘇后用生理鹽水洗滌兩遍，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果按臨床需要將細(xì)胞和復(fù)方電解質(zhì)溶液混勻待用；并留樣進(jìn)行內(nèi)毒素和細(xì)菌檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟一中，所述臍帶保存液為無(wú)血清培養(yǎng)基，不含抗生素。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟一中，所述篩選的檢測(cè)項(xiàng)目包括攜帶病毒或遺傳家族史。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟三中，所述胰蛋白酶的濃度為0.05％，由0.25％成品胰酶稀釋5倍。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟三中，所述完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例為10％；谷氨酰胺比例0.02mmol/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟四中，所述無(wú)菌檢測(cè)包括用血培養(yǎng)儀進(jìn)行細(xì)菌和真菌檢測(cè)；所述支原體檢測(cè)包括用PCR法進(jìn)行支原體檢測(cè)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臨床用間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟四中，所述冷凍保存所用細(xì)胞冷凍保護(hù)液由完全培養(yǎng)基和二甲基亞砜配制而成，其中二甲基亞砜終濃度10％。