[發明專利]一種檢測人血清中總睪酮的方法

有效

• 申請號: 201410484568.5
• 申請日: 2014-09-19
• 公開（公告）號: CN104215716A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 何翠紅;趙蓓蓓;程雅婷;李卓陽;佘旭輝;董衡;李維;劉偉霞;梁曉翠
• 申請（專利權）人: 沈陽金域醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 鄭彤;萬志香

技術領域

本發明涉及分析檢測技術領域，特別是涉及一種高通量液相色譜串聯質譜法檢測人血清中總睪酮的方法。

背景技術

睪酮是一種類固醇荷爾蒙，由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，腎上腺亦分泌少量；但絕經后婦女，卵巢分泌睪酮顯著減少。在男性中，它對外生殖器和第二性征的發育起著重要作用，其生物化學過程尚未完全闡明。女性中，其主要作用是作為一種雌激素的前體。同時，睪酮可能影響許多身體系統和功能，包括：血生成，體內鈣平衡，骨礦化作用，脂代謝，糖代謝和前列腺增長。

大多數睪酮與性激素結合球蛋白(SHBG)結合，在男性中也被稱為睪丸激素結合球蛋白；少數與白蛋白結合，一小部分以游離形式存在。游離睪酮被認為是生物活性成分。然而，睪酮與白蛋白結合較弱，所以所有非SHBG結合的睪酮被認為是生物可利用的。

在兒童期，過多睪酮會誘發男孩性早熟和女孩的男性化。在成年女性中，過量的睪酮會造成不同程度的男性化，包括多毛，痤瘡，月經稀發，或不育。睪酮輕度至中度升高對男性通常無明顯癥狀，但對女性造成嚴重的影響。對于睪酮輕度至中度升高的確切原因往往不清楚。明顯升高的常見原因包括遺傳疾病(如先天性腎上腺皮質增生癥)，腎上腺，睪丸和卵巢的腫瘤和運動員濫用睪丸激素或促性腺激素通。女性的睪酮降低會引起微妙的癥狀，這主要包括性欲下降和非特異性的情緒變化。在男性，它會導致性腺功能減退，這個特點將改變男性的第二性征和生育功能。

傳統的睪酮檢測方法有酶聯免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫分析法(RIA)、化學發光免疫檢測(CLISA)、自動化免疫分析系統、高效液相色譜法和氣相色譜-質譜法等，現有的睪酮檢測方法，主要存在如下問題：第一、由于睪酮在人體內主要與性激素結合球蛋白(SHBG)結合，且人體內存在大量的高親和力結合蛋白，因此檢測存在嚴重的基質干擾。而傳統的免疫法，不能有效祛除基質干擾；第二，免疫學檢測方法是建立在抗體對抗原分子識別的基礎上，由于人體內存在大量的與睪酮結構相似的化合物，所以該檢測技術的特異性差，易導致假陽性的出現，尤其是在睪酮濃度水平較低的情況下，傳統的免疫方法無法準確測定；第三，高效液相色譜法和氣相色譜-質譜法，前處理復雜，分析時間長，靈敏度低；第四，現有的高效液相色譜-串聯質譜法和氣相色譜-質譜法整個檢測過程時間長、檢測通量低。

因此，需要本領域技術人員迫切解決的一個技術問題就是：如何能夠提供一種適用于人血清中總睪酮的檢測方法，前處理簡單，能有效祛除基質干擾，可以準確定量極低濃度(<100ng/dL)的睪酮，并且整個檢測過程時間短、通量高。

發明內容

本發明實施例所要解決的技術問題是提供一種適用于人血清總睪酮的高通量的檢測方法，該方法靈敏度低，能夠準確定量極低濃度(<100ng/dL)的睪酮，能夠有效去除基質干擾，快速檢測，通量高。

為了解決上述問題，本發明公開了一種高通量液相色譜串聯質譜法檢測人血清中總睪酮的方法，具體的技術方案如下：

一種高通量液相色譜串聯質譜法檢測人血清中總睪酮的方法，包括如下步驟：

(1)前處理

向人血清樣品的試管中加入含睪酮內標物的內標液，混勻后加入甲基叔丁基醚進行蛋白沉淀并萃取睪酮，然后離心后置于-65～-75℃條件下放置1-2h，接著轉移上清液并進行干燥，然后加入復溶劑，得到待測樣品；

其中，所述睪酮內標物為睪酮的碳代標記物或氘代標記物；所述內標液與人血清樣品的體積比為1:10～1:4；所述人血清樣品、甲基叔丁基醚及復溶劑的體積比為2:8:1～2:15:1；

(2)檢測

對所述待測樣品采用高通量液相色譜串聯四級桿質譜儀進行檢測；

其中色譜條件為：色譜柱為C18色譜柱；柱溫為48-52℃；流動相為甲醇和水，流速為0.5-1ml/min，采用梯度洗脫：起始流動相甲醇:水的體積比為35:65，待測物出峰時流動相甲醇:水的體積比為60:40，而后再回到起始流動相甲醇:水的體積比為35:65，并保持1～2min，整個梯度的時間為3～8min；

質譜條件為：采用正離子模式，掃描方式采用多反應監測離子掃描MRM；

目標定量離子的多反應監測離子掃描MRM的條件為：睪酮母離子的質/荷比為289.2～290.2，對應的子離子的質/荷比為97.1～98.1。

在其中一個實施例中，內標的定量離子對的多反應監測離子掃描MRM的條件為：內標母離子的質/荷比為290.2～296.2，對應的子離子的質/荷比為110.1～116.1。