[發(fā)明專利]一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410482598.2
• 申請(qǐng)日: 2014-09-20
• 公開（公告）號(hào): CN104278087A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭狄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山鼎晟生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 中山市銘洋專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 44286
• 代理人: 鄒常友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

豬肉是人們?nèi)粘Ｉ钪械闹饕馐称贩N，豬肉中微生物的含量是否達(dá)標(biāo)直接關(guān)系到大家的飲食健康。空腸彎曲桿菌是豬肉類食品中最容易感染的微生物之一。它是引起全球人類及動(dòng)物食源性細(xì)菌胃腸炎的主要原因，可引起急性腸炎及腹瀉，報(bào)道顯示，空腸彎曲桿菌感染占所有食源性細(xì)性菌感染的47%，能導(dǎo)致散發(fā)性和地方流行性胃腸炎爆發(fā)，尤其以惡性腫瘤、艾滋病、慢性疾病、兒童及老年人發(fā)病率最高，此外，還可引起格林巴利綜合征（GBS），反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等多種并發(fā)疾病，其中格林巴利綜合征（GBS）是最嚴(yán)重的并發(fā)癥，可致感染者死亡。

空腸彎曲桿菌引起的胃腸現(xiàn)病例數(shù)已超過(guò)沙門氏菌及李斯特菌，其作為一項(xiàng)感染率極高的致病菌，目前已作為食品安全、畜牧獸醫(yī)及公共衛(wèi)生等領(lǐng)域的常規(guī)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

傳統(tǒng)的檢測(cè)與分離方法為生化及血清凝集試驗(yàn)，但培養(yǎng)周期長(zhǎng)、檢驗(yàn)程序復(fù)雜、確診檢驗(yàn)結(jié)果需10-20d，且報(bào)告結(jié)果差異大，該菌生長(zhǎng)條件苛刻，食品中該菌數(shù)量極少，傳統(tǒng)的選擇性富集培養(yǎng)，很難從樣品中檢出，且該菌還存在一種“存在但不可培養(yǎng)”的狀態(tài)，給傳統(tǒng)方法檢出帶來(lái)極大的困難。因此，尋求一種能對(duì)食品空腸彎曲桿菌進(jìn)行快速檢測(cè)、檢測(cè)靈敏度度且的方法十分重要。

變性高效液相色譜（DHPLC）通過(guò)反相高效液相色譜原理，對(duì)核苷酸片段分子進(jìn)行分離，操作全自動(dòng)化，準(zhǔn)確度和靈敏度高，但對(duì)于食品中空腸彎曲桿菌含量極低時(shí)，檢測(cè)結(jié)果并不十分準(zhǔn)確。本發(fā)明提供一種檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確性高的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確性高的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒包括培養(yǎng)基和檢測(cè)液；所述的培養(yǎng)基為肉湯；所述的檢測(cè)液由以下含量的組分制成:

10PCR?Buffer?緩沖液????????????????3~5μl，

Taq?DNA?聚合酶??????????????????0.2~0.4μl，?

dNTP???????????????????????????????3~5μl，??

100bp?DNA?Ladder?Marker??????????0.1~0.6μl，

PCR引物???????????????????????????1~?2μl,

Tris.Cl?????????????????????????????5~10mg，

氯化鈉????????????????????????????1~2.2mg，

氯化鎂????????????????????????????1~2.2mg，

十二水磷酸氫二鈉?????????????????0.2~0.5mg，

增菌液?????????????????????????????3~5?mg。

優(yōu)選的，所述的肉湯為Bolton肉湯，肉湯中含有0.3%~0.5%重量份的生長(zhǎng)促進(jìn)劑。

優(yōu)選的，所述的生長(zhǎng)促進(jìn)劑為焦亞硫酸鈉、丙酮酸鈉與硫酸亞鐵按2:1:5的重量份混合的混合物。

優(yōu)選的，所述的PCR引物為：C16S-F：5’-CTG?CTT?AAC?ACA?AGT?TGA?GTA?GG-3’(183～205)，C16S-R：5’-TTC?CTT?AGG?TAC?CGT?CAG?AA-3’(449～468)。

優(yōu)選的，所述的Taq?DNA?聚合酶濃度為2-5U/μl。

優(yōu)選的，所述的dNTP濃度為5-10mmol/L，所述的PCR引物濃度為10-25μmol/L。

一種采用上述檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，包括以下步驟：

（1）量取10PCR?Buffer?緩沖液3~5μl，Taq?DNA?聚合酶0.2~0.4μl，dNTP3~5μl，100bp?DNA?Ladder?Marker?0.1~0.6μl，PCR引物?1~?2μl,Tris.Cl?5~10mg，氯化鈉1~2.2mg，氯化鎂1~2.2mg，十二水磷酸氫二鈉0.2~0.5mg，增菌液3~5?mg，配置成檢測(cè)液；

在Bolton肉湯中加入0.3%~0.5%重量份的生長(zhǎng)促進(jìn)劑制得培養(yǎng)基；

（2）取待測(cè)豬肉樣品2~5g，研碎，接種于培養(yǎng)基中，于微需氧條件下培養(yǎng)；