[發明專利]一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201410482598.2
• 申請日: 2014-09-20
• 公開（公告）號: CN104278087A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發明（設計）人: 郭狄
• 申請（專利權）人: 中山鼎晟生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 中山市銘洋專利商標事務所(普通合伙) 44286
• 代理人: 鄒常友

1.一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒包括培養基和檢測液；所述的培養基為肉湯；所述的檢測液由以下含量的組分制成:

10PCR?Buffer?緩沖液?????????????????3~5μl，

Taq?DNA?聚合酶??????????????????0.2~0.4μl，?

dNTP???????????????????????????????3~5μl，??

100bp?DNA?Ladder?Marker??????????0.1~0.6μl，

PCR引物???????????????????????????1~?2μl,

Tris.Cl?????????????????????????????5~10mg，

氯化鈉????????????????????????????1~2.2mg，

氯化鎂????????????????????????????1~2.2mg，

十二水磷酸氫二鈉?????????????????0.2~0.5mg，

增菌液?????????????????????????????3~5?mg。

2.根據權利要求1所述的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的肉湯為Bolton肉湯，肉湯中含有0.3%~0.5%重量份的生長促進劑。

3.根據權利要求2所述的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的生長促進劑為焦亞硫酸鈉、丙酮酸鈉與硫酸亞鐵按2:1:5的重量份混合的混合物。

4.根據權利要求1所述的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的PCR引物為：C16S-F：5’-CTG?CTT?AAC?ACA?AGT?TGA?GTA?GG-3’(183～205)，C16S-R：5’-TTC?CTT?AGG?TAC?CGT?CAG?AA-3’(449～468)。

5.根據權利要求1所述的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的Taq?DNA?聚合酶濃度為2-5U/μl。

6.根據權利要求1所述的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的dNTP濃度為5-10mmol/L，所述的PCR引物濃度為10-25μmol/L。

7.一種采用如權利要求1~6中任一所述的檢測試劑盒檢測豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）量取10PCR?Buffer?緩沖液3~5μl，Taq?DNA?聚合酶0.2~0.4μl，dNTP3~5μl，100bp?DNA?Ladder?Marker?0.1~0.6μl，PCR引物?1~?2μl,Tris.Cl?5~10mg，氯化鈉1~2.2mg，氯化鎂1~2.2mg，十二水磷酸氫二鈉0.2~0.5mg，增菌液3~5?mg，配置成檢測液；

在Bolton肉湯中加入0.3%~0.5%重量份的生長促進劑制得培養基；

（2）取待測豬肉樣品2~5g，研碎，接種于培養基中，于微需氧條件下培養；

（3）取增菌液接種于步驟（2）中的培養基中，按細菌基因組小量提取待測樣品DNA；

（4）將步驟（3）中待測樣品DNA加入檢測液中，并加入滅菌超純水，離心，進行PCR反應，?94℃變性、72℃變性，進入循環，35個循環后72℃終止延伸，制得樣品PCR產物；

（5）DHPLC分析：色譜柱：PS-DVB；C18DNASep；柱溫40-50℃；色譜柱：4.5?mm×50mm；流動相體積比：0、30s、60s、120s、240s時緩沖溶液A：緩沖溶液B之比分別為：（55%：45%）、（50.2%：49.8%）、（44.2%：55.8%）、（40.9%：59.1%）、（38.8%：61.2%）；流速：（0.5-0.8）ml/min；進樣量：PCR產物?（2-5）μl;?PCR檢測器：熒光檢測器。

8.根據權利要求7所述的一種檢測豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，其特征在于，步驟（5）中所述的緩沖溶液A為TEAA水溶液，其濃度為0.5-0.8mmol/L。