[發明專利]一種使用硫酸軟骨素酶生產硫酸乙酰肝素的工藝

在審

• 申請號: 201410480890.0
• 申請日: 2014-09-19
• 公開（公告）號: CN104293866A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 楊曉宏;郭林;李榮;崔慧斐;李福川;陳少鵬;張中志
• 申請（專利權）人: 東營天東制藥有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26
• 代理公司: 東營雙橋專利代理有限責任公司 37107
• 代理人: 羅文遠

技術領域

本發明涉及一種生產硫酸乙酰肝素的工藝，特別涉及一種使用硫酸軟骨素酶生產硫酸乙酰肝素的工藝。

背景技術

????硫酸乙酰肝素是一廣泛存在于動物細胞表面的糖胺聚糖,?是藥物舒洛地特的主要組成部分。它在細胞的信號傳導、增生與分化、免疫調節、細胞黏附以及神經細胞的信息傳遞等方面具有重要的生物學功能?。硫酸乙酰肝素在組成糖基和糖苷鍵連接方式上類似肝素，但比肝素具有抗栓活性強?,抗凝活性弱的優點?。由于其負電荷密度和分子量與硫酸皮膚素相近，故分離純化硫酸乙酰肝素成為制約藥物開發的難點。曾有文獻表明，利用硫酸皮膚素與硫酸乙酰肝素結構上的不同，用班氏試劑可以與硫酸皮膚素生產沉淀從而將兩者分離開來。但此方法收率低、周期長、成本高且引入較難除去的雜質銅離子而不被選擇。

發明內容

本發明的目的就是針對現有技術存在的上述缺陷，提供一種使用硫酸軟骨素酶生產硫酸乙酰肝素的工藝，利用這兩種酶能夠專一選擇切斷硫酸皮膚素氨基己糖和艾杜糖醛酸二糖之間的1-4糖苷鍵，將硫酸皮膚素降解成二糖小分子，從而與硫酸乙酰肝素分離開來，能夠得到大批量的精品硫酸乙酰肝素。

一種使用硫酸軟骨素酶生產硫酸乙酰肝素的工藝，包括如下制作步驟，濃度按質量百分比：

A將肝素鈉粗品溶于濃度為2％的氯化鈉溶液中，采用酶解法酶解，對酶解液用陰離子交換樹脂充分吸附；

B步驟A中的陰離子交換樹脂用濃度為3.0%-6.0%的氯化鈉溶液進行洗脫，得到洗脫液經乙醇沉淀烘干得到洗脫物；

C步驟B中得到的洗脫物溶為10.0%濃度，調節pH值為8.0-8.5，添加洗脫物重量2.0%-3.5%的CaCl₂，后添加洗脫物重量3.0%-4.5%的Na₂CO₃充分攪拌反應，將沉淀過濾除去得到上清液；

D將步驟C中的上清料液調節pH值為6.0-7.0，溫度20-40℃，加入硫酸軟骨素ABC酶量為：酶/洗脫物=1000-2000?IU/Kg，攪拌酶解8-12h；或調節上清料液pH值7.0-8.5，溫度20-40℃，加入硫酸軟骨素B酶量為：酶/洗脫物=1500-2500?IU/Kg洗脫物，攪拌酶解8-12h；

E將酶解液用C步驟再次除蛋白，調pH值至7.0，用3K超濾膜進行超濾3-4h，取截留液用乙醇1.5-2.0倍沉淀；

F將步驟E所得沉淀物用純化水溶解，加入乙二胺四乙酸EDTA進行攪拌、吸附、過濾，濾液用1.5-2.0倍藥用乙醇沉淀，所得的沉淀物溶解并用雙氧水氧化4h；

G將步驟F所得料液加入1.5-2.0倍藥用乙醇沉淀，棄上清，所得固體沉淀物再用純化水溶成10%濃度，經0.22微米濾芯過濾，然后真空冷凍干燥，最終得到硫酸乙酰肝素精品。

優選的，本發明提到的酶解法是指：

調節步驟A的肝素鈉溶液pH值8.0-8.5、溫度35-38℃，加入肝素鈉粗品重量的1.0%-2.0%的胰蛋白酶解3-4h，酶解完畢調料液pH值7.0-7.5，用強堿型陰離子交換樹脂對其充分吸附。

本發明與現有工藝相比，其優點和有益效果在于：

1.???本發明中前期獲得低鹽度洗脫物并不影響肝素鈉的收率，并且為肝素鈉的前期生產過程除掉大部分雜質；

2.???本發明中所用到的酶制劑是基因重組酶，它是將來源于肝素黃桿菌的硫酸軟骨素B酶基因與麥芽糖結合蛋白基因融合于大腸桿菌中可溶性表達獲得此酶，與傳統酶相該酶具有酶效高、催化能力強，每升料液體積含酶活在5000IU-7700?IU之間；

3.???與傳統工藝相比，利用酶制劑得到硫酸乙酰肝素收率高、純度高、生產周期短且不會引入重金屬雜質。

具體實施方式

實施例1：