[發明專利]一種分析蛋白O-糖基化位點的方法

有效

• 申請號: 201410475759.5
• 申請日: 2014-09-17
• 公開（公告）號: CN104198613A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 遲連利;白雪;李道遠
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/89
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種分析蛋白O-糖基化位點的方法，特別涉及一種采用內切酶和外切酶部分降解糖鏈并聯合液質聯用技術對糖蛋白O-糖基化位點進行檢測和鑒定的方法，屬于生物技術技術領域。

背景技術

蛋白的糖基化是一種重要的翻譯后修飾。主要有N-糖基化(N-glycosylation)和O-糖基化(O-glycosylation)兩種形式。蛋白糖基化參與了細胞的很多過程，并扮有重要的角色。此外，癌癥等一些疾病的發生發展過程常伴隨著蛋白的糖基化位點及糖鏈的異常變化。因此，糖基化位點的分析對于研究揭示糖蛋白的異常變化至關重要。位點分析不僅可以直觀的得到特殊疾病的標志物糖基化的改變信息，也能使進一步的糖鏈結構位點特異性分析變得更加直接方便。

因為N-糖基化發生在蛋白質特征序列上，有共同的五糖核心結構，并且具有從蛋白質上釋放N-糖鏈的通用糖苷內切酶，因此，蛋白N-糖基化位點的分析方法已經很成熟。相比之下，O-糖基化位點的分析具有極大的挑戰。O-糖基化發生在絲氨酸或者蘇氨酸上，沒有特征修飾序列可做修飾位點預測；O-糖鏈的結構較復雜，至少存在8種核心結構；并且，還沒有發現能將O糖鏈從蛋白上釋放的通用內切酶，這些原因使得O-糖基化位點的分析困難重重。

通常O-糖基化位點的分析會用到化學釋放法如β-消除法(Zheng?Y,et?al.Talanta2009，78:358-363)，但是化學法有時難以控制會產生一些副反應。除以上方法外，還有其它的一些外切酶方法(P?et?al.J?Proteome?Res，2007，6:3021-3031)，鑒定得到的O-糖基化位點比較有限。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種混合外切酶法分析蛋白O-糖基化位點，可用于糖蛋白等疾病生物標志物糖基化位點的分析。

發明概述

本發明利用內切酶與混合外切酶切去N糖鏈與O-糖鏈，連接N-糖鏈的天冬酰胺變為天冬氨酸，連接O-糖鏈的絲氨酸或蘇氨酸只留有一個GalNAc糖標簽。單個蛋白的肽段采用LC/MS/MS直接分析，發生O-糖基化的肽段分子量增加203Da，通過高分辨質譜獲得精確分子量以及二級碎片信息，據此找出O-糖基化位點。組學樣本的O-糖基化分析，先用榴蓮凝集素將切剩一個GalNAc單位的糖肽富集，從而對位點進行分析。該方法簡單，快速，高通量，可以用于標準樣品和實際樣品的糖基化位點的檢測。

發明詳述

一種分析蛋白O-糖基化位點的方法，步驟如下：

(1)將蛋白質組樣品或單個蛋白樣品經內切酶酶切后，再經內切糖苷酶和外切糖苷酶組合切除N糖鏈與部分O-糖鏈，經減壓干燥，制得帶有GalNAc糖標簽的肽段和非糖肽的組學蛋白樣品或單個蛋白樣品；

(2)將步驟(1)制得的帶有GalNAc糖標簽的肽段和非糖肽的組學蛋白樣品上樣于榴蓮凝集素色譜柱進行分離，收集到酶切后帶有GalNAc糖標簽的肽段溶液，經減壓干燥后，制得組學蛋白樣品；

(3)將步驟(1)制得的單個蛋白樣品或步驟(2)制得的組學蛋白樣品使用C₁₈反相色譜柱分離，然后在正離子模式下用高分辨質譜儀進行檢測，得到高分辨質譜圖；

(4)將得到的質譜數據用Mascot?Distiller軟件進行處理，再用MASCOT在SwissProt數據庫中進行搜索，參數設定如下：

酶最大漏切位點：2；

固定修飾：Carbamidomethylation，半胱氨酸；

可變修飾：+HexNAc，203Da，絲氨酸和蘇氨酸；+0.9840Da，天冬酰胺變成天冬氨酸；氧化，甲硫氨酸；乙酰化，N-末端；環化，N-末端；

母離子質量誤差為15ppm，二級碎片質量誤差為0.8Da；通過搜庫結果獲得蛋白糖基化位點信息。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中內切酶為：胰蛋白酶或蛋白內切酶Glu-C(金黃色葡萄球菌V8)，內切酶與蛋白樣品的質量比為1：(20～30)。

根據本發明優選的，所述步驟(1)中內切糖苷酶為：肽N-糖苷酶F(PNGase?F)。