[發明專利]一種分析蛋白O-糖基化位點的方法

有效

• 申請號: 201410475759.5
• 申請日: 2014-09-17
• 公開（公告）號: CN104198613A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 遲連利;白雪;李道遠
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/89
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

1.一種分析蛋白O-糖基化位點的方法，其特征在于，步驟如下：

(1)將蛋白質組樣品或單個蛋白樣品經內切酶酶切后，再經內切糖苷酶和外切糖苷酶組合切除N糖鏈與部分O-糖鏈，經減壓干燥，制得帶有GalNAc糖標簽的肽段和非糖肽的組學蛋白樣品或單個蛋白樣品；

(2)將步驟(1)制得的帶有GalNAc糖標簽的肽段和非糖肽的組學蛋白樣品上樣于榴蓮凝集素色譜柱進行分離，收集到酶切后帶有GalNAc糖標簽的肽段溶液，經減壓干燥后，制得組學蛋白樣品；

(3)將步驟(1)制得的單個蛋白樣品或步驟(2)制得的組學蛋白樣品使用C₁₈反相色譜柱分離，然后在正離子模式下用高分辨質譜儀進行檢測，得到高分辨質譜圖；

(4)將得到的質譜數據用Mascot?Distiller軟件進行處理，再用MASCOT在SwissProt數據庫中進行搜索，參數設定如下：

酶最大漏切位點：2；

固定修飾：Carbamidomethylation，半胱氨酸；

可變修飾：+HexNAc，203Da，絲氨酸和蘇氨酸；+0.9840Da，天冬酰胺變成天冬氨酸；氧化，甲硫氨酸；乙酰化，N-末端；環化，N-末端；

母離子質量誤差為15ppm，二級碎片質量誤差為0.8Da；通過搜庫結果獲得蛋白糖基化位點信息。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中內切酶為：胰蛋白酶或蛋白內切酶Glu-C，內切酶與蛋白樣品的質量比為1：(20～30)。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中內切糖苷酶為：肽N-糖苷酶F。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中外切糖苷酶為：β(1-3,4)半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和唾液酸酶A的混合；進一步優選的，每100μg經內切酶酶切后的樣品或單個蛋白樣品加入每種內切糖苷酶和外切糖苷酶的量均為1μl，所述β(1-3,4)半乳糖苷酶的濃度為≥2U/ml、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的濃度為≥40U/ml、唾液酸酶的濃度為≥5U/ml。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中內切糖苷酶和外切糖苷酶的酶切條件均為：37℃條件下酶切24h。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中榴蓮凝集素色譜柱按如下方法制備：將1.7mL的偶聯榴蓮凝集素的瓊脂糖凝膠裝于1×1900mm的全氟烷氧基樹脂管中，偶聯榴蓮凝集素濃度為3.5～4.5mg/ml，制得榴蓮凝集素色譜柱。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中榴蓮凝集素色譜柱的分離條件如下：流速100μL/min，用洗滌緩沖液洗脫8個柱體積，再用含0.8M半乳糖的洗脫緩沖液洗脫5個柱體積；將洗脫液收集后，用HyperSep?C18柱脫鹽，即得；

所述洗滌緩沖液為100mM?Tris–HCl,pH?7.4。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中C₁₈反相色譜柱的流動相A為含有甲酸和乙腈的溶液，甲酸質量濃度為0.1％，乙腈質量濃度為2％；流動相B為含有甲酸和乙腈的溶液，甲酸質量濃度為0.1％，乙腈質量濃度為98％。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中C₁₈反相色譜柱的的檢測條件如下：

將步驟(1)制得的酶切后單個蛋白樣品或步驟(2)制得的組學蛋白樣品溶于流動相A中，配制成濃度為0.5～1.5μg/μL的待測溶液；

流速50μL/min，洗脫梯度為：0～5min，98％流動相A，2％流動相B；5～25min，85～98％流動相A，2～15％流動相B，25～55min，60～85％流動相A，15～40％流動相B，55～60min，2～60％流動相A，40～98％流動相B，60～70min，2％流動相A，98％流動相B。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中高分辨質譜采用LTQ-Orbitrap?Velos?Pro型高分辨質譜，設定參數為：同位素分辨率：60000；掃描質量范圍：400～1800；數據采集采用數據依賴模式；碰撞能量設定為35％。