[發明專利]一種環氧化物水解酶及其編碼基因和應用

在審

• 申請號: 201410475055.8
• 申請日: 2014-09-17
• 公開（公告）號: CN104450641A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 王華磊;吳鍇;魏東芝
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12P41/00;C12P17/02
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鄧琪;宋麗榮

技術領域

本發明涉及酶催化領域，更具體地涉及一種環氧化物水解酶及其編碼基因和應用。

背景技術

環氧化物水解酶(EC?3.3.2.3)是一組功能相似的酶系，能夠立體選擇性催化環氧化合物生成光學純的環氧化物和相應鄰位二醇。作為一種水解酶它具有一般水解酶的特點如：反應不需要輔酶的協助；具有廣泛的來源；在非水溶劑中仍具有催化活力；以及這些反應常常顯示出化學、區域和立體對映選擇性，能夠對同類型廣泛的底物進行作用。

環氧化物水解酶廣泛存在于自然界中，在哺乳動物、昆蟲、微生物和植物中均有發現。由于微生物種類的多樣性、生長速度快、易于培養和產量高等優點，從微生物中篩選獲得環氧化物水解酶是目前主要的途徑。近年，已從多種微生物中發現了環氧化物水解酶，如Rhodococcus?equi，Rhodococcus?ruber，Mycoplana?rubra，Bacillus?megaterium,Diplodia?gossipina，Streptomyces?striana,Rhodotorula?glutinis,Bacillus?subtilis,Sphingomonasechinoides，Rhodotorula?araucariae，Rhodosporidium?toruloides，Agrobacterium?radiobacter，Mycobacter?tuberculosis，Aspergillus?niger，Caulobacter?crescentus，Trichosporon?loubierii，Sphingomonas?sp，Novosphingobium?aromaticivorans，Saccharomyces?cerevisiae等。其中部分環氧化物水解酶的基因已被克隆并在不同的宿主(大腸桿菌、畢赤酵母、耶氏酵母等)中表達，獲得產酶活力較高的基因工程菌，并應用于不對稱拆分外消旋環氧化物，其中來自Aspergillus?niger的環氧化物水解酶已經上市。

由于環氧化物能夠被多種親核試劑開環，所以環氧化物是應用廣泛的合成中間體。在對手性純藥物的持續擴大的需求下，酶法制備手性化合物是溫和無污染低能耗的綠色途徑。在對映純芳香環氧化物的制備方法中，環氧化物水解酶以低價格外消旋環氧化物為底物，不需要昂貴的輔酶參與，反應條件簡單溫和，并且底物產物分離工藝簡便，是首選的制備途徑。

目前，手性的苯基縮水甘油醚及其衍生物可用于合成β-受體阻滯劑、保護神經的化合物和BACE抑制劑。隨著手性藥物的不斷出現，光學純的苯基縮水甘油醚及其衍生物將有更加廣泛的用途。但是，目前仍沒有一種環氧化物水解酶能夠高效地以外消旋苯基縮水甘油醚為底物制備R構型的苯基縮水甘油醚的方法。

發明內容

為了解決上述現有技術中存在的無法通過高選擇性的環氧化物水解酶以外消旋苯基縮水甘油醚為底物制備光學純的R構型苯基縮水甘油醚的問題，本發明旨在提供一種環氧化物水解酶及其編碼基因和應用。

本發明提供一種環氧化物水解酶，該環氧化物水解酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

本發明提供一種環氧化物水解酶的編碼基因，該編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發明提供一種環氧化物水解酶的應用，所述環氧化物水解酶以外消旋的芳香環氧化物為底物制備手性的芳香環氧化物。

所述芳香環氧化物為苯基縮水甘油醚、間甲基苯基縮水甘油醚、間硝基苯基縮水甘油醚或對甲基苯基縮水甘油醚。

所述底物溶解于二甲基亞砜中，所述環氧化物水解酶溶解于pH為7～8的緩沖液或純水中，兩者混合形成反應體系。具體地，溶解于二甲基亞砜中的外消旋的芳香環氧化物底物，于pH?7～8緩沖液或純水的反應體系中進行轉化反應，在25～35℃、100～250r/min條件下轉化反應0.05～2h得到含手性的芳香環氧化物的混合液，將混合液分離純化，獲得手性芳香環氧化物。其中，優選地，所述底物的初始濃度為400mM，所述凍干菌體的質量用量以菌體干重計為10mg/ml底物。

所述環氧化物水解酶的制備方法包括：S1，將來源于DSM20162?Tsukamurella?paurometabola的SEQ?ID?NO：1所示的環氧化物水解酶的基因構建載體，將載體轉化大腸桿菌；S2，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養，培養液分離獲得含環氧化物水解酶的菌體細胞。