[發(fā)明專利]一種云芝發(fā)酵提取胃蛋白酶抑制劑的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410473759.1
• 申請日: 2014-09-17
• 公開（公告）號: CN104195202A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉巴寧;鄭安喬
• 申請（專利權(quán)）人: 中山安蕎生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K14/81;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 東莞市中正知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 44231
• 代理人: 侯來旺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種云芝發(fā)酵提取胃蛋白酶抑制劑的方法。

背景技術(shù)

天冬氨酸蛋白酶的活性中心一般由兩個(gè)天冬氨酸殘基組成，目前主要包括胃蛋白酶、凝乳酶、溶酶體酶等。天冬氨酸蛋白酶抑制劑可增強(qiáng)免疫力、抗癌及降壓，對老年癡呆及胃潰瘍等患者也具有顯著的療效，目前在食品保健及醫(yī)藥行業(yè)中應(yīng)用十分廣泛。但目前化學(xué)合成天冬氨酸蛋白酶抑制劑安全性得不到保證，如沙奎那韋可引起脂質(zhì)代謝紊亂，因此，其實(shí)際應(yīng)用受到明顯限制。

云芝(Coriolusversicolor)又稱為采絨革蓋菌、千層蘑、彩云革蓋菌等,?隸屬真菌門、擔(dān)子菌亞門、多孔菌科、革蓋菌屬,是我國傳統(tǒng)的名貴藥材。云芝味甘、?淡,?性微寒,?有健脾利濕,?止咳平喘,?清熱解毒,抗腫瘤的功效。云芝多糖是云芝的主要有效成分，能激活免設(shè)細(xì)胞、提高機(jī)體免疫功能，抗腫瘤、降血脂及抗菌，此外，云芝多糖對慢性應(yīng)激引起的學(xué)習(xí)和記憶障礙等均有顯著的改善效果，因此，云芝多糖可作為一種安全有效的活性物質(zhì)，應(yīng)用于保健食品中。云芝深層發(fā)酵可制得其中一種天冬氨酸蛋白酶抑制劑-胃蛋白酶抑制劑，其不僅具有胃蛋白酶抑制劑的作用，還具有云芝多糖等云芝其他生理活性物質(zhì)等的活性功能。目前，已有學(xué)者報(bào)道將云芝發(fā)酵提取胃蛋白酶抑制劑及其純化，但存在操作繁瑣或胃蛋白酶抑制劑產(chǎn)是不高等缺點(diǎn)。為此，本發(fā)明提供能一種云芝發(fā)酵提取胃蛋白酶抑制劑的方法，該方法可對胃蛋白酶抑制劑進(jìn)行充分提取，且操作簡單。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷提供一種云芝發(fā)酵胃蛋白酶抑制劑的提取方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種云芝發(fā)酵提取胃蛋白酶抑制劑的方法，其特征于，包括以下步驟：

（1）樣品預(yù)處理：取云芝3-5g冷凍干燥至恒重，粉碎過篩，取篩下樣品粉末備用；

（2）菌種培養(yǎng)活化：取步驟（1）中制得的樣品粉末置入斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到活化的菌株；

（3）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：取步驟（2）中活化的菌株置入發(fā)酵瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，得菌株發(fā)酵液；

（4）胃蛋白酶抑制劑的提取：將步驟（3）中制得的菌株發(fā)酵液進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，離心，經(jīng)大孔樹脂脫色，取上清液透析后進(jìn)行胃蛋白酶抑制劑的純化,制得胃蛋白酶抑制劑。

優(yōu)選的，其特征于，步驟（1）中所述的粉碎過篩為過40-80目篩。

優(yōu)選的，步驟（2）中所述的斜面培養(yǎng)基的組分為：馬鈴薯15-25%，葡萄糖1-3%，磷酸二氫鉀0.1-0.5%，硫酸鎂水合物0.1-0.3%，瓊脂1-3%。

優(yōu)選的，步驟（3）中所述的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：馬鈴薯汁30-50%，葡萄糖1-3%,硫酸鎂水合物0.1-0.3%，硫酸鈉0.03-0.08%，磷酸二氫鉀0.1-0.5%。

優(yōu)選的，步驟（2）中所述的斜面培養(yǎng)基及步驟（3）中所述的搖瓶種子培養(yǎng)基均為在121℃條件下濕熱滅菌30-40min的培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，步驟（2）中所述的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25-28℃，培養(yǎng)時(shí)間3-5d。

優(yōu)選的，步驟（3）中所述的培養(yǎng)條件為：搖床速度200-220r/min，培養(yǎng)溫度25-28℃，培養(yǎng)時(shí)間3-5d；步驟（4）中所述的超聲波細(xì)胞破碎時(shí)的操作條件為：功率為250-300W，溫度為20-25℃，時(shí)間為5-8min。

優(yōu)選的，步驟（4）中所述的離心的速度為13000-150000r/min,離心時(shí)間為5-10min。

步驟（4）中所述的胃蛋白酶抑制劑的純化的具體方法為：采用DEAE-52離子交換層析，以流動相A液洗脫2倍柱床體積后，以20%B液梯度洗脫，取透析后的上清液上樣。

優(yōu)選的，所述的流動相A液為0.02-0.05mol/L?,PH為6.5-7.0的磷酸鹽緩沖液，B液為0.5-0.8mol/L,PH為6.5-7.0的磷酸鹽緩沖液，所述的洗脫速度為0.8-1.0ml/min,上樣量為3ml。

對步驟（4）中制得的胃蛋白酶抑制劑采用Lowry法測定濃度，采用常規(guī)蛋白酶測定法測定其活力。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：