[發明專利]使用農桿菌注射轉化草莓果實的操作方法

在審

• 申請號: 201410473543.5
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104212832A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 王媛花;賈思振;蔡善亞;顏志明;郭正兵;王全智
• 申請（專利權）人: 江蘇農林職業技術學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/08
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王云

1.一種使用農桿菌注射轉化草莓果實的操作方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

1）將攜帶包含?GUS?基因的?pCAMBIA2301?質粒的農桿菌菌液在固體培養基上劃線后挑取單菌落在液體培養基中于28℃搖菌培養至菌液OD600為0.8～2.4，將菌液離心后倒去上清液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀用MS?液體培養基懸浮液重懸，重懸后測定菌液OD600在0.8～2.4，將重懸后的菌液放于冰箱備用；

2）用無菌注射器將步驟（1）得到的重懸后的菌液注射至果實中；

3）摘取注射后第三天至第七天之間的果實，切成薄片，放入GUS染色液中，進行染色鑒定，染色過夜后用體積濃度70%酒精去除葉綠素后統計轉化效率；

4）摘取注射后第三天至第七天之間的果實，提取果實RNA，反轉錄為cDNA后進行熒光定量PCR，檢測gus基因表達量。

2.根據權利要求1所述的使用農桿菌注射轉化草莓果實的操作方法，其特征在于，所述步驟1）中農桿菌為根癌農桿菌EHA105、AGL0和GV3101中的任意一種。

3.根據權利要求1所述的使用農桿菌注射轉化草莓果實的操作方法，其特征在于，所述步驟1）中菌液OD600為0.8～1.2。

4.根據權利要求1所述的使用農桿菌注射轉化草莓果實的操作方法，其特征在于，所述步驟1）中固體培養基為：?LB固體培養基50?mL+卡那霉素50mg?/L+利福平100mg/?L，其中LB固體培養基配方：每一升LB固體培養基中包含胰蛋白胨?10g,酵母提取物?5g,氯化鈉?10g以及瓊脂?15g。

5.根據權利要求1所述的使用農桿菌注射轉化草莓果實的操作方法，其特征在于，所述步驟1）中液體培養基為：LB液體培養基50?mL+卡那霉素50mg?/L+利福平100mg/?L；其中LB液體培養基配方：每一升LB液體培養基中包含胰蛋白胨?10g,酵母提取物?5g,氯化鈉?10g。

6.根據權利要求1所述的使用農桿菌注射轉化草莓果實的操作方法，其特征在于，所述步驟2）中果實為草莓品種“紅顏”?每年3?-5月不同成熟期的果實，此時按照不同的發育時期分為七個不同的時期，第一個時期為種子剛剛完全形成，并且密集的分別在草莓果實周圍，花托并不能看清楚；第二個時期為花托可以清晰的看見，果莖大約為0.3～0.5厘米；第三個時期為果實開始膨脹，果實變得很大，果莖大小約為0.8～1.5厘米；第四個時期為草莓果實開始從綠果向白果轉化；第五個時期是草莓果實白果期，果實完全變為白色；第六個時期和第七個時期為紅果期，紅果期也可以分為兩個時期，一個是果實開始變紅大約一半左右，另一個時期果實完全為紅色。

7.根據權利要求6所述的使用農桿菌注射轉化草莓果實的操作方法，其特征在于，所述果實采用第四個時期和第五個時期的果實。

8.根據權利要求1所述的使用農桿菌注射轉化草莓果實的操作方法，其特征在于，所述步驟2）中注射位置選擇果柄處，注射量為直到菌液溢出為止。

9.根據權利要求1所述的使用農桿菌注射轉化草莓果實的操作方法，其特征在于，所述步驟3）、步驟4）中摘取注射后第五天的果實。