[發(fā)明專利]使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410473543.5
• 申請(qǐng)日: 2014-09-16
• 公開（公告）號(hào): CN104212832A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王媛花;賈思振;蔡善亞;顏志明;郭正兵;王全智
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/08
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于草莓的瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和瞬時(shí)基因表達(dá)分析領(lǐng)域，尤其涉及一種使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法。

背景技術(shù)

草莓（Fragaria×ananassa）是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的作物。?由于草莓的雜合性和多倍性，種間或種內(nèi)雜交通常難以獲得雜種，常規(guī)育種工作量大、效率低。隨著基因工程和生物技術(shù)的飛速發(fā)展，可以利用轉(zhuǎn)基因的方法來有效改良草莓品種，縮短育種周期，提高育種效率。草莓轉(zhuǎn)基因發(fā)展非常迅猛，在基因測(cè)序和克隆方面，國內(nèi)近幾年研究了與草莓相關(guān)的50多種基因，有些已經(jīng)轉(zhuǎn)到草莓體內(nèi)并得到表達(dá)。

通過近幾年草莓基因工程的發(fā)展，已在草莓中分離得到了許多與果實(shí)的形成發(fā)育以及成熟生理代謝等相關(guān)的重要功能基因，對(duì)這些基因的功能進(jìn)行鑒定是非常重要的研究目標(biāo)之一。而基因的功能驗(yàn)證的一個(gè)重要途徑就是通過轉(zhuǎn)基因操作來進(jìn)行。草莓轉(zhuǎn)基因研究在園藝作物中開展較早，早在80年代就已經(jīng)成功獲得了草莓轉(zhuǎn)基因的植株。其中根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法是草莓遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的方法。但如果采用常規(guī)葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因來研究基因的功能就需得到轉(zhuǎn)基因植株，并在其開花結(jié)果后才能觀察分析，而草莓轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)周期長，一般從開始轉(zhuǎn)基因到獲得轉(zhuǎn)基因植株，到植株開花結(jié)果需要1-2年的時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)于研究一些功能尚未明確的基因來說時(shí)間周期過長，所需人力也很大。此外穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化也不適于研究一個(gè)家族大批量的基因功能，一般研究的基因數(shù)量比較小，因此需要尋求一種新的，快速的方法來研究與果實(shí)的形成發(fā)育以及成熟生理代謝等相關(guān)的重要基因的功能。

果實(shí)注射法是近年來以園藝作物果實(shí)為轉(zhuǎn)化材料發(fā)展起來的一種對(duì)目的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化從而鑒定其功能的新方法，該方法操作簡便，周期短。一般注射后一周左右便可以可直接觀察轉(zhuǎn)化后果實(shí)的形態(tài)以及生理等方面的變化，也可以對(duì)果實(shí)進(jìn)行分子生物學(xué)相關(guān)的檢測(cè)研究來確定基因功能，從而研究導(dǎo)入基因的功能與作用。最初的果實(shí)注射法以注射某些藥物來觀察果實(shí)的生長發(fā)育狀況，?2001年國外科學(xué)家首次利用該方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化梨、蘋果、番茄、桃、草莓果實(shí)細(xì)胞的研究。2008年有報(bào)道利用果實(shí)注射法研究了基因在草莓果實(shí)中的功能。而且這些注射法多采用的是離體果實(shí)注射，這樣就不能完全反應(yīng)果實(shí)的生長以及發(fā)育過程的變化狀況。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速，便捷的使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

一種使用農(nóng)桿菌注射轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)的操作方法，該方法包括如下步驟：

1）將攜帶包含?GUS?基因的?pCAMBIA2301?質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液在固體培養(yǎng)基上劃線后挑取單菌落在液體培養(yǎng)基中于28℃搖菌培養(yǎng)至菌液濃度為0.8～2.4，將菌液離心后倒去上清液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀用MS?液體培養(yǎng)基懸浮液重懸，重懸后測(cè)定菌液濃度在0.8～2.4，將重懸后的菌液放于冰箱備用；

2）用無菌注射器注射農(nóng)桿菌懸浮液至果實(shí)中；

3）摘取注射后第三天至第七天之間的果實(shí)，切成薄片，放入GUS染色液中，進(jìn)行染色鑒定，染色過夜后用體積濃度70%酒精去除葉綠素后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率；

4）摘取注射后第三天至第七天之間的果實(shí)，提取果實(shí)RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)gus基因表達(dá)量。

所述步驟1）中農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌EHA105、AGL0和GV3101中的任意一種，優(yōu)選AGL0。

所述步驟1）中固體培養(yǎng)基為?LB固體培養(yǎng)基+卡那霉素50mg?/L+利福平100mg/?L，液體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基+卡那霉素50mg?/L+利福平100mg/?L。

所述步驟1）中菌液濃度為0.8～2.4，菌液濃度在0.8～1.2時(shí)轉(zhuǎn)化效率都比較高，菌液濃度高于1.2，不僅轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降，而且注射后會(huì)導(dǎo)致果實(shí)腐爛壞死。

所述步驟2）中果實(shí)為草莓品種“紅顏”?每年3?-5月不同成熟期的果實(shí)，此時(shí)按照不同的發(fā)育時(shí)期分為七個(gè)不同的時(shí)期，第一個(gè)時(shí)期為種子剛剛完全形成，并且密集的分別在草莓果實(shí)周圍，花托并不能看清楚；第二個(gè)時(shí)期為花托可以清晰的看見但是果實(shí)還是很小；第三個(gè)時(shí)期為果實(shí)開始膨脹，果實(shí)變得很大；第四個(gè)時(shí)期為草莓果實(shí)開始從綠果向白果轉(zhuǎn)化；第五個(gè)時(shí)期是草莓果實(shí)白果期，果實(shí)完全變?yōu)榘咨坏诹鶄€(gè)時(shí)期和第七個(gè)時(shí)期為紅果期，紅果期也可以分為兩個(gè)時(shí)期，一個(gè)是果實(shí)開始變紅大約一半左右，另一個(gè)時(shí)期果實(shí)完全為紅色，優(yōu)選第四個(gè)時(shí)期和第五個(gè)時(shí)期的果實(shí)。