[發明專利]一種重組布氏白僵菌蛋白酶K及其工業化生產與純化方法

有效

• 申請號: 201410472748.1
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104232611B
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 丁海平;李坤;梁良
• 申請（專利權）人: 合肥巔峰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/58
• 分類號: C12N9/58;C12N15/57;C12N15/81
• 代理公司: 合肥中谷知識產權代理事務所(普通合伙) 34146
• 代理人: 洪玲

本發明公開了一種重組布氏白僵菌蛋白酶K及其工業化生產與純化方法，涉及基因改造和蛋白質工程技術領域，通過生物信息手段得到適于畢赤酵母重組表達的重組白僵菌蛋白酶K編碼基因，合成該優化基因并在真核系統表達成功，得到了酶活明顯大于傳統林伯氏白色念球菌蛋白酶K的重組蛋白酶K，并提供了該重組白僵菌蛋白酶K的工業化生產與純化方法。本發明通過化學合成該編碼基因并構建GS115/pPIC9K?ProK高產工程菌，克服了天然產品產量低、費用高的缺陷，并顯著降低了相關產業的蛋白酶K使用成本，具有廣泛的應用前景。

技術領域：

本發明涉及基因改造和蛋白質工程技術領域，具體涉及一種重組布氏白僵菌蛋白酶K及其工業化生產與純化方法。

背景技術：

蛋白酶K(Proteinase K,EC 3.4.21.64,又名肽鏈內切酶K、腐生真菌堿性蛋白酶、白色念球菌絲氨酸蛋白酶、白色念球菌蛋白酶K)，是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。該蛋白可通過切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵降解天然角蛋白(keratin)，并因此而得名。由于蛋白酶K在鹽酸胍(3M)、尿素(4M)和SDS(0.5-1％)中均可以穩定存在并具有降解蛋白質的能力，因而被廣泛應用于脈沖電泳用染色體DNA制備、蛋白質印跡以及去除DNA和RNA制品中的核酸酶。

蛋白酶K最早于1974年從林伯氏白色念球菌中純化得到。但一直以來天然菌株培養困難、產量過低的問題嚴重阻礙了蛋白酶K的實際應用。1985年測定其天然氨基酸序列后，多個國家的研究者及相關公司投入了很大精力嘗試實現該蛋白的大規模重組表達，于2000年前后實現該蛋白在大腸桿菌系統中的重組表達，但此方法只能得到包涵體蛋白，變復性過程導致生產成本增高、產量損失嚴重；直到2008年左右才實現了該蛋白的畢赤酵母系統分泌表達，至此，林伯氏白色念球菌蛋白酶K的生產和應用進入了一個快速發展的時期。與此同時，林伯氏白色念球菌蛋白酶K野生型及各種突變體的表達純化專利在很短時間內被各大國際制藥公司壟斷(Patent No.:WO 02/072634 A2,US 7368274 B2)，作為后入者的中國企業很難繞開相關專利保護加入到該酶的研發、生產和銷售過程中去。

為解決上述問題，本發明人對公開基因數據庫中的蛋白酶K同源序列進行了深入的生物信息學分析，結合已有蛋白酶K晶體結構及保守位點比對，發現布氏白僵菌中的一種蛋白酶基因其編碼產物可能具有完整的蛋白酶K生物學活性。經過編碼基因優化改造、真核細胞-酵母細胞外分泌表達得到該重組蛋白酶，經生物化學及酶學實驗測定證明該蛋白具有完整的蛋白酶K活性，且其蛋白酶活性較野生型林伯氏白色念球菌蛋白酶K高出50％。通過優化表達系統，本發明人利用酵母細胞外分泌表達技術大規模發酵高效表達該重組蛋白酶K，并進一步提高該酶的活性及產量；采用高效親和蛋白純化方式，提高蛋白酶K在純化過程中的回收率，實現該酶的規模化和連續化生產，完成了本發明。迄今為止，在專利文件及非專利文件中均未發現關于布氏白僵菌重組蛋白酶K工業生產的報道。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題在于提供一種活性好、設計合理、操作簡單的重組布氏白僵菌蛋白酶K及其工業化生產與純化方法。

本發明所要解決的技術問題采用以下的技術方案來實現：

一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，含有全長氨基酸序列、特別是含有第99到第380位氨基酸序列或與該區段氨基酸序列同源性高于95％的氨基酸序列，且具有蛋白酶K的生物活性。

所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的DNA編碼方法是將野生型布氏白僵菌蛋白酶K的編碼序列替換為宿主細胞偏好密碼子組成的DNA序列，減去原有信號肽序列并加入組氨酸標記及酶切位點后，再通過化學合成的方式制備得到的。

所述宿主細胞偏愛密碼子為酵母偏愛密碼子。

所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的表達載體具有這樣的結構：將所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的DNA表達的啟動子序列連接到編碼重組氏白僵菌蛋白酶K的DNA上游，也可將終止子連接到重組氏白僵菌蛋白酶K的DNA下游。