[發(fā)明專利]一種重組布氏白僵菌蛋白酶K及其工業(yè)化生產(chǎn)與純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410472748.1
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104232611B
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 丁海平;李坤;梁良
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥巔峰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/58
• 分類號: C12N9/58;C12N15/57;C12N15/81
• 代理公司: 合肥中谷知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 34146
• 代理人: 洪玲

1.一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的DNA編碼序列為：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于，所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的表達(dá)載體具有這樣的結(jié)構(gòu)：將所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的DNA表達(dá)的啟動子序列連接到編碼重組氏白僵菌蛋白酶K的DNA上游，將終止子連接到重組氏白僵菌蛋白酶K的DNA下游。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的表達(dá)載體選用pPICZ、pPICZ Q、pGAPZ、pGAPZ Q、pGAPZ Q A和pPIC9K。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的表達(dá)載體中插入用于挑選重組體的選擇標(biāo)記基因或用于檢測導(dǎo)入基因表達(dá)的報告基因，所述選擇標(biāo)記基因包括潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因，報告基因包括β-葡糖醛酸酶(GUS)基因、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因、熒光素酶(LUC)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的表達(dá)載體中包含附加序列，使重組布氏白僵菌蛋白酶K以融合蛋白的形式表達(dá)，所述附加序列包括編碼信號肽或前肽的核苷酸序列，以及編碼His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽的核苷酸序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于，所述真核細(xì)胞為酵母細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述酵母細(xì)胞選用畢赤酵母細(xì)胞、假絲酵母細(xì)胞、多型漢遜酵母細(xì)胞、球擬酵母細(xì)胞、裂殖酵母細(xì)胞和克魯維酵坶細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述畢赤酵母細(xì)胞為GS115酵母細(xì)胞，并采用電擊轉(zhuǎn)化法獲得畢赤酵母的轉(zhuǎn)化體：先將線性化表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞中，再將菌體懸液涂布于平板上，培養(yǎng)平板直至出現(xiàn)單個菌落。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組布氏白僵菌蛋白酶K，其特征在于：所述重組布氏白僵菌蛋白酶K的試劑盒包含重組氏白僵菌蛋白酶K、編碼重組氏白僵菌蛋白酶K的DNA、表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的一種或多種，還另外包括一種或多種組分，組分由試管、反應(yīng)緩沖液、PCR引物、dNTP、Taq聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA酶、RNA酶抑制劑、DEPC水和無菌水構(gòu)成。