[發(fā)明專利]人源化的FcγR小鼠

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410471291.2
• 申請日: 2010-12-17
• 公開（公告）號: CN104232589A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: L·麥克唐納;涂納新;C·古爾;S·史蒂文斯;A·J·墨菲
• 申請（專利權(quán)）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 北京商專永信知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11400
• 代理人: 鄔玥;葛強(qiáng)

本申請是申請?zhí)枮?01080064262.4、申請日為2010年12月17日、發(fā)明名稱為“人源化的FcγR小鼠”的中國發(fā)明專利申請的分案申請，原申請為國際申請?zhí)枮镻CT/US2010/060925的國家階段申請，該國際申請要求申請日為2009年12月21日，申請?zhí)枮?1/288,562的美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明領(lǐng)域是缺失內(nèi)源鼠FcγR基因的遺傳修飾的非人動物，包括內(nèi)源FcγR基因被人FcγR基因替代的遺傳修飾的動物，包括能夠表達(dá)至少2、3、4或5種功能性人低親和力FcγR基因的小鼠，以及包括包含不表達(dá)內(nèi)源低親和力FcγR基因的免疫細(xì)胞的遺傳修飾的小鼠。

背景

Fc受體(FcR)是在哺乳動物的進(jìn)行免疫系統(tǒng)的多種功能的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的表面上發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。FcR以多種類型存在于多種細(xì)胞上，并且介導(dǎo)多種免疫功能，例如結(jié)合附著至被感染的細(xì)胞或侵襲性病原體的抗體、刺激吞噬細(xì)胞或細(xì)胞毒性細(xì)胞以通過抗體介導(dǎo)的吞噬作用或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)破壞微生物或感染的細(xì)胞。

ADCC是這樣的過程：免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞裂解被抗體結(jié)合的靶細(xì)胞。該過程依賴于對外源抗原或細(xì)胞的先行接觸，從而產(chǎn)生抗體應(yīng)答。ADCC可通過效應(yīng)細(xì)胞例如天然殺傷(NK)細(xì)胞，通過效應(yīng)細(xì)胞表面上表達(dá)的FcR對本身結(jié)合至外源抗原或細(xì)胞的抗體的Fc部分的結(jié)合來介導(dǎo)。由于FcR在免疫應(yīng)答中起著中心作用，因此需要有共表達(dá)多種人FcR的有用的非人動物，包括共表達(dá)多種人低親和力FcR的非人動物。存在對用于研究和闡明人疾病治療(特別是抗腫瘤治療和用于治療自身免疫疾病的治療)和藥物開發(fā)(特別是在人抗體藥劑的開發(fā)、設(shè)計(jì)和測試中)的人FcR功能和人的ADCC過程的非人動物模型。

附圖概述

圖1是小鼠的野生型低親和力FcγR基因座的示意圖，顯示了小鼠FcγRIIB,FcγRIV和FcγRIII基因以及用于這些基因的靶向缺失的小鼠FcγR靶向載體，其包括側(cè)翼連接有位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的新霉素盒。

圖2顯示了就B細(xì)胞(抗-CD19),NK細(xì)胞(抗-NKp46)和巨噬細(xì)胞(抗-F4/80)門控的脾細(xì)胞的直方圖，包括野生型和低親和力FcγRα鏈基因缺陷型小鼠(mFcγR?KO)的內(nèi)源mFcγRII和mFcγRIII基因的表達(dá)。

圖3A-3D顯示了在人源化CD20小鼠(hCD20)和培育成FcγR敲除小鼠的人源化CD20小鼠(hCD20/FcγR?KO)中在幾個(gè)淋巴細(xì)胞區(qū)室(lymphocyte?compartment)：骨髓(圖3A)、血液(圖3B)、淋巴結(jié)(圖3C)和脾(圖3D)中利用具有小鼠Fc(Ab?168)或人Fc(Ab?735)的人抗-人CD20抗體對B細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)耗盡。對于每一個(gè)圖，y-軸顯示門控的B細(xì)胞(B220⁺/IgM⁺或B220⁺/CD19⁺)的百分比，x-軸顯示每一個(gè)動物組的抗體劑量：10mg/kg對照抗體(C)，2mg/kg人抗-人CD20抗體(2Ab和10mg/kg人抗-人CD20抗體(10Ab)。

圖4是低親和力小鼠FcγR基因座的新霉素靶向缺失和用于將兩個(gè)人低親和力FcγR基因(hFcγRIIIA和hFcγRIIA)插入缺失的小鼠基因座的第二靶向載體的示意性描述，所述第二靶向載體包括側(cè)翼連接有位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的潮霉素盒。為了在血小板上表達(dá)hFcγRIIA，使用了可操作地連接于人FcγRIIIA-IIA靶向載體的hFcγRIIA基因的延長的啟動子區(qū)域；為了阻止在血小板上表達(dá)hFcγRIIA，刪除或?qū)嵸|(zhì)上刪除所述啟動子區(qū)域。

圖5A顯示針對NK細(xì)胞(抗-NKp46和巨噬細(xì)胞(抗-F4/80)的門控的脾細(xì)胞的直方圖，包括野生型和人FcγRIIIA-IIA純合子小鼠(人FcγRIIIA/FcγRIIA?HO)的人FcγRIIIA的表達(dá)。

圖5B顯示針對嗜中性粒細(xì)胞(抗-Ly6G)和巨噬細(xì)胞(抗-F4/80)的門控的脾細(xì)胞的直方圖，包括野生型和人FcγRIIIA-IIA純合子小鼠(人FcγRIIIA/FcγRIIA?HO)的人FcγRIIA的表達(dá)。