[發明專利]一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法

有效

• 申請號: 201410471164.2
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104232772B
• 公開（公告）日: 2017-03-29
• 發明（設計）人: 陳放;李佛生;毛強;詹誠;唐琳
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙)51238
• 代理人: 黎祖琴

技術領域

本發明涉及分子生物領域，特別涉及一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法。?

背景技術

小分子RNAs（miRNAs）是一類非編碼的內源性RNAs，在多細胞物種乃至單細胞物種中都有被發現，小RNA可以反應轉錄到翻譯水平的基因表達情況，因此，在不同組織和不同發育階段，其表達量有很大的差異，不同小RNA之間也有很大差異。一系列的研究數據表明，小RNA（miRNAs）能夠通過互補堿基修復模式在轉錄后水平上調控基因表達，也可以在DNA水平上通過促使DNA甲基化來調控基因表達。因此，小RNA在幾乎所有生物學方面包括生理的，生化的，發育的及病理的反應過程中都起著重要的作用。此外，在活細胞中還有許多其他的非編碼小分子RNAs，它們也在基因表達過程中起著重要而特別的作用，如21nt的siRNAs能夠初始化RNA干擾從而對基因表達進行抑制，snRNA大概150nt，對于?剪切類反應起到了催化作用，26-31?nt的piwiRNAs參與信使RNA（mRNA）的降解和轉錄抑制。?

因此，要研究小RNA的功能和機制，必須掌握在活細胞生化過程中準確地測定小分子RNAs的方法。目前，小分子RNA檢測包括下一代測序、Northern雜交、RT-PCR（實時PCR）及生物芯片。其中，下一代測序方法會得到大量的數據，需要人工及計算機進行長時間的分析和篩選，且需要用其他實驗來驗證；生物芯片的制作需要特別的工具材料及專業知識，普通實驗室難以獨立完成；RT-PCR雖然快速靈敏，但針對小RNA的檢測，需要對反應的探針進行仔細的設計，且特異的探針花費較高。?

1.????Northern雜交可重復性高，結果好，經常作為RNA檢測中的黃金標準來測定基因表達水平。但是傳統方法靈敏度低，實驗時間長，對人體和環境也有害。Wang等（Wang?X,?Tong?Y,?Wang?S:?Rapid?and?accurate?detection?of?plant?miRNAs?by?liquid?northern?hybridization.?Int?J?Mol?Sci?2010,?11:3138–3148）在2010年設計并提出了一種液相雜交快速檢測小分子RNA的方法，彌補了傳統Northern雜交耗時耗力并有危險性的缺點，但是，其靈敏度較低，約0.1pmol，不適用于檢測表達量較低的小分子RNA。?Li等（Li?X,?Ni?M,?Zhang?Y:?Detecting?miRNAs?by?liquid?hybridization?and?color?development.?Methods?2012,?58:151-155.）在液相雜交的基礎上提出了顏色觀察法，將雜交后的核酸轉移到膜上并通過免疫結合放大信號，使靈敏度提高到了2.5fmol。但是這種方法不能顯示條帶，從而無法區分序列相似的小分子RNA，也難以實現多種小分子RNA的檢測。郭耀輝等在“生物素標記探針－液相雜交－非變性?ＰＡＧＥ檢測非編碼小?ＲＮＡ?方法的建立和優化”（國際檢驗醫學雜志２０１２年３月第３３卷第６期）建立了生物素標記-液相雜交-非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測非編碼小RNA的方法，但這種方法由于無法去除多余探針，有較大的背景干擾問題，容易產生假陽性結果影響判斷，難以實現靈敏、精確的檢測。實際檢測效果上，要獲得較好的檢測信號，該方法所需的探針濃度高達10?umol/L；并且所需的時間較長，從雜交到檢出信號，不包括電泳分離和轉膜所花的時間就需時5小時。?

發明內容

本發明的發明目的在于：針對上述存在的問題，提供一種兼顧靈敏度和檢測效率的新的檢測小分子RNA的方法。?

本發明采用的技術方案是這樣的，一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，包括以下步驟:?

（1）提取、純化待檢測小分子RNA；

（2）探針設計：根據待檢測小分子RNA的堿基序列設計探針，所述探針用生物素或地高辛進行標記；

（3）液相雜交：將所述待檢測小分子RNA與所述探針在緩沖液中進行雜交，并消化掉未雜交的單鏈序列，然后進行凝膠電泳；

（4）轉膜：將電泳后的凝膠上的雜交產物轉移到固相支持物上；

（5）抗體孵育：將步驟（4）所得到的含有雜交產物的固相支持物與特異性抗體進行孵育雜交；

（6）信號檢測：檢測步驟（5）所得的固相支持物上的信號。