[發(fā)明專利]一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410471164.2
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104232772B
• 公開（公告）日: 2017-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳放;李佛生;毛強;詹誠;唐琳
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 成都玖和知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)51238
• 代理人: 黎祖琴

1.一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）提取、純化待檢測小分子RNA；

（2）探針設(shè)計：根據(jù)待檢測小分子RNA的堿基序列設(shè)計探針，所述探針用生物素或地高辛進行標記；

（3）液相雜交：將所述待檢測小分子RNA與所述探針在緩沖液中進行雜交，并消化掉未雜交的單鏈序列，然后進行凝膠電泳；

（4）轉(zhuǎn)膜：將電泳后的凝膠上的雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到固相支持物上；

（5）抗體孵育：將步驟（4）所得到的含有雜交產(chǎn)物的固相支持物與特異性抗體進行孵育雜交；

（6）信號檢測：檢測步驟（5）所得的固相支持物上的信號。

2.如權(quán)利要求1所述的一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，其特征在于，還包括線性回歸方程制作步驟：采用一系列濃度梯度的已知miRNA分別進行所述步驟（3）-（6）的操作，然后以已知miRNA的濃度為X軸，顯色濃度為Y軸建立曲線坐標。

3.如權(quán)利要求1所述的一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，其特征在于，所述固相支持物為尼龍膜、纖維素膜和PVDF膜中的任何一種，優(yōu)選尼龍膜。

4.如權(quán)利要求1所述的一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，其特征在于，步驟（2）中，探針設(shè)計時，根據(jù)待檢測小分子RNA的堿基序列，設(shè)計成DNA形式，根據(jù)此設(shè)計反向互補的寡核苷酸，并在5’端隨機增加2個核苷酸后，再用生物素或地高辛標記。

5.如權(quán)利要求1所述的一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，其特征在于，步驟（3）中所述凝膠為含1×TBE的?10%-15%的聚丙烯酰胺凝膠；步驟（3）中，雜交反應(yīng)體系于95℃變性0.5?min以上，然后在42-65℃雜交0.5?min以上。

6.如權(quán)利要求1所述的一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，其特征在于，步驟（3）中，用核酸外切酶消化了未雜交上的多余單鏈；雜交緩沖液中，磷酸根濃度為0-0.5?M，Na⁺濃度為0-1.5?M,EDTA濃度為0-0.5?M，pH為6.0-9.5。

7.如權(quán)利要求1所述的一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，其特征在于，步驟（4）中，轉(zhuǎn)膜時，根據(jù)凝膠的大小裁剪6張同樣大小的濾紙，及1張固相支持物，按照從下到上依次為3層濾紙、凝膠、固相支持物、3層濾紙的順序?qū)R擺放，然后將上述的濾紙、凝膠、固相支持物的“三明治”結(jié)構(gòu)夾在兩層濕潤的固相支持物中間。

8.如權(quán)利要求1所述的一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，其特征在于，步驟（5）中，先將含有雜交產(chǎn)物的固相支持物加入封閉液后在20-37℃下孵育1?min以上，棄封閉液，然后加入稀釋的抗體，在20-37℃下孵育5?min以上。

9.如權(quán)利要求1所述的一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，其特征在于，步驟（3）中，雜交反應(yīng)體系于95℃變性5?min，然后在42℃雜交1h；步驟(5)中，先將含有雜交產(chǎn)物的固相支持物加入封閉液后在37℃下孵育5?min，棄封閉液，然后加入稀釋的抗體，在37℃下孵育30?min。

10.如權(quán)利要求1所述的一種快速靈敏檢測小分子RNA的方法，其特征在于，步驟（6）中，采用CDP-Star檢測方法或者X壓片方法進行信號檢測。