[發明專利]用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因及制備方法

有效

• 申請號: 201410470682.2
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104195148A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 徐毅;汪惠麗
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/10
• 代理公司: 合肥金安專利事務所 34114
• 代理人: 金惠貞

技術領域

本發明屬于基因克隆分離技術領域，尤其涉及于一種來源于真核微藻的有關多不飽和脂肪酸合成的去飽和酶基因及其分離方法。

背景技術

多不飽和脂肪酸是人體必需的重要的營養物質，真核微藻因富含多不飽和脂肪酸而成為重要的生物資源。綠色巴夫藻?(Pavlova?viridis)含有豐富的EPA?（二十碳五烯酸）與DHA（二十二碳六烯酸），該微藻是進行多不飽和脂肪酸相關合成基因識別與克隆的良好實驗材料。

SEFA-PCR全稱self-formed?adaptor?PCR，是一種通過引物“回頭”形成適配子的方式來完成染色體行走的一種PCR技術。與其他如反向PCR等技術相比，SEFA-PCR具有擴增片段長、可靠性高、無需酶切連接步驟等優點。SEFA-PCR在擴增長未知DNA片段時尤其有效。SEFA-PCR全程需要三個引物的參與，分別是SP1,?SP2和SP3。其中SP1和SP2是退火溫度較高的特異性引物，而SP3則是一個從5’到3’末端分別含有15個特異性堿基、9個隨機堿基與6個特異性堿基的部分兼并引物。

SOE全稱Splicing?by?overlap?extension，是一種不受酶切位點限制通過聚合酶鏈式反應獲得基因拼合的方法。其原理是進行兩端擴增的引物本身有一部分是反向互補的，通過大片段互為引物擴增的方式來獲得經過拼合后的基因全長。SOE方法的優點是簡單快捷，缺點是容易引入錯配堿基，需要重復實驗確認拼接結果。

在真核微藻的DHA的體內合成途徑中，起到最關鍵作用的是多不飽和脂肪酸去飽和酶和多不飽和脂肪酸延伸酶兩大酶類。但由于其為與內質網結合的膜蛋白，上述酶類在分子水平上的研究受到很大限制。其中，delta-5去飽和酶是合成二十碳五烯酸EPA的最后一個關鍵酶，其在合成途徑中的地位是極為重要的。目前在真核微藻中已經有數個來自于不同物種的delta-5去飽和酶獲得了分離和識別，但不同物種的同源酶顯然都存在序列上和結構上的差異，進而導致其酶活性和功能的不同。因此，從綠色巴夫藻中分離得到其delta-5去飽和酶的同源酶是對該部分研究資源的很好補充，本發明就試圖從這個角度展開相關的工作。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因及制備方法。

用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因的DNA序列為SEQ?ID?No.1。

?制備所述的綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因的具體操作步驟如下：

首先，從綠色巴夫藻中分離獲得綠色巴夫藻的基因組DNA；接著，以綠色巴夫藻的基因組DNA為模板，根據去飽和酶基因保守組氨酸框的序列設計簡并引物P3F和P3R，從而擴增得到保守區基因；接下來，分別對其5’末端和3’末端進行染色體歩移獲得全基因序列，通過普通PCR的方法獲得基因全長。

本發明首次從綠色巴夫藻的基因組中分離獲得了推定的多不飽和脂肪酸delta-5去飽和酶基因，豐富了該類酶的重要的基因資源，為進一步研究該酶的體內和體外的作用機制奠定了基礎。

綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因可直接應用于多不飽和脂肪酸EPA的合成，為通過分子生物學手段體外合成EPA這種重要的營養物質提供了最關鍵的基因元件，其在畢赤酵母中的異源表達和轉化實驗如下：