[發明專利]用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因及制備方法

有效

• 申請號: 201410470682.2
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104195148A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 徐毅;汪惠麗
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/10
• 代理公司: 合肥金安專利事務所 34114
• 代理人: 金惠貞

1.用于EPA合成的一種綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因，其特征在于：所述綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因的DNA序列為SEQ?ID?No.1。

2.制備權利要求1所述的綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因的方法，其特征在于：

首先，從綠色巴夫藻中分離獲得綠色巴夫藻的基因組DNA；接著，以綠色巴夫藻的基因組DNA為模板，根據去飽和酶基因保守組氨酸框的序列設計簡并引物P3F和P3R，從而擴增得到保守區基因；接下來，分別對其5’末端和3’末端進行染色體歩移獲得全基因序列，通過普通PCR的方法獲得基因全長。

3.根據權利要求2所述制備綠色巴夫藻delta-5去飽和酶基因的方法，其特征在于：具體操作步驟如下：

（1）?利用本領域常規的DNA、RNA提取分離手段從綠色巴夫藻中獲得綠色巴夫藻的基因組DNA和總mRNA；

（2）delta-5去飽和酶基因的保守區擴增過程如下：

（2.1）使用5?μl?RNA作為模板，利用多聚胸腺嘧啶寡核苷酸引物（oligo?dT?Primer）：5’-oligod(T)15GTAAAACGACGGCCAGT-3’逆轉錄合成cDNA第一鏈；

（2.2）以上述cDNA第一鏈作為模板，并根據delta-5去飽和酶同源基因的保守性設計上游引物P3F、下游引物P3R來進行保守區基因的擴增；所述上游引物P3F的DNA序列為：5’-TTGCAGCACATGGGCGGCCACTAC-3’；?所述下游引物P3R的DNA序列為：?5’-AGCCATGTGGTGCTCGATCTCTGGTA-3’；PCR反應條件為：94℃預變性時間3?min；94℃變性時間30?s，60℃退火時間?30?s，72℃延伸時間1?min,?30個循環；72℃后延伸時間?10?min；其具體的10μl反應體系如下：上游引物P3F、下游引物P3R各0.4μl；10?×PCR?buffer?1μl；dNTP?2.5?mM?each?0.8μl；Easytaq酶?0.2μl；去離子水6.2μl；

本步驟（2）擴增得到delta-5去飽和酶基因的保守區片段；

（3）delta-5去飽和酶基因兩端基因的克隆通過SEFA-PCR的方法來完成，具體步驟如下：

（3.1）獲得delta-5去飽和酶基因的保守區3’末端片段；

（3.1.1）在10?μl無引物的所述常規PCR體系中，加入1μl?SP3-3’引物，94℃變性時間30s，35-45℃退火時間30s，然后以0.2度/s的速度升至70度，接下來以70℃延伸5min；

（3.1.2）加入3μl?SP1-3’引物，?94℃變性時間30s，以70℃退火和延伸5min，進行兩個循環；

（3.1.3）94℃變性時間30s，以70℃退火和延伸5min，再以94℃變性時間30s，?55-60℃退火時間30s，70℃延伸時間5min，進行25個循環；

第二輪反應是只使用SP2-3’引物的普通的PCR反應，反應條件設為94℃預變性時間?3?min；94℃變性時間30?s,?70℃退火時間?30?s，72℃延伸時間1?min，進行30個循環；最后72℃延伸時間10?min；

本步驟擴增得到delta-5去飽和酶基因的保守區3’末端片段；

以上所述的3’末端的引物序列為：

SP1-3’：5’-?GCTTCCCGTCCCCAGGGTCGAGTATG-3’；

SP2-3’：5’-?TCGTGGTGGTGCGACTGGTGGATGT-3’；

SP3-3’：5’-CCTACCTCAACTACCAGANNNNNNNNNACATGG-3’；

（3.2）獲得delta-5去飽和酶基因的保守區5’末端片段；

（3.2.1）在10?μl無引物的所述常規PCR體系中，加入1μl?SP3-5’引物，94℃變性時間30s，35-45℃退火時間30s，然后以0.2度/s的速度升至70度，接下來以70℃延伸5min；

（3.2.2）加入3μl?SP1-5’引物，?94℃變性時間30s，以70℃退火和延伸5min，進行兩個循環；

（3.2.3）94℃變性時間30s，以70℃退火和延伸5min，再以94℃變性時間30s，?55-60℃退火時間30s，70℃延伸時間5min，進行25個循環；

第二輪反應是只使用SP2-5’引物的普通的PCR反應，反應條件設為94℃預變性時間?3?min；94℃變性時間30?s,?70℃退火時間?30?s，72℃延伸時間1?min，進行30個循環；最后72℃延伸時間10?min；

本步驟擴增得到delta-5去飽和酶基因的保守區5’末端片段；

以上所述的5’末端的引物序列為：

SP1-5’：5’-?TGCGGCGTCGCGTGGTGCTTGTTGTG-3’；

SP2-5’：5’-?ACCCGACATGCCGCAACCGAG-3’；

SP3-5’：5’-?CCATACACCGCGACCTGANNNNNNNNNGATTCG-3’；

將所有獲得的基因片段連入pMD18T載體轉化入大腸桿菌宿主菌后挑取轉化子，進行測序，分別獲得所述基因的保守區片段的DNA序列以及5’?末端的DNA序列、3’末端的DNA序列，利用常規的DNA序列拼接方法將上述三個序列拼接到一起，得到的多不飽和脂肪酸delta-5去飽和酶的全長多核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。