[發明專利]一種攜帶靶向分裂期磷蛋白1基因的小發夾RNA的重組溶瘤腺病毒

在審

• 申請號: 201410470155.1
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104195117A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 黃昆;劉欣然;鄭凌;吳瓊
• 申請（專利權）人: 武漢百奧京生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/861;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

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技術領域

本發明涉及生物藥學領域，具體來說，涉及一種攜帶靶向人源驅動蛋白——分裂期磷蛋白1基因的小發夾RNA的重組溶瘤腺病毒及其制備方法。

背景技術

原發性肝癌在世界范圍內每年約發病26萬例。我國肝癌發病率約占全世界的40%以上，每年新發病例約10余萬。我國肝癌死亡率位居所有癌癥死亡人數的第二位，每年約有13萬患者死于肝癌。傳統外科切除和微創外科手術是目前主要的治療手段。然而由于肝部瘤體積過大、位置不佳以及肝功能儲備不足等原因常常導致手術失敗，再加上術后的高復發率使得手術治療肝癌往往達不到預期。而由于肝癌對化療的不敏感性或易產生耐藥性等原因，單獨運用化學療法治療肝癌的效果十分有限。因此，作為新興的治療手段，基因療法治療肝癌被寄予厚望。

目前，我國一類新藥“今又生”——重組人p53腺病毒注射液，是世界上第一個以重組腺病毒作為載體進行癌癥基因治療的上市藥物，臨床上主要用于治療鼻咽癌、頭頸部鱗癌、喉癌等實體瘤。但這類以非復制型腺病毒載體攜帶抗癌基因的藥物在臨床應用上也存在難以克服的不足之處。首先，以一類新藥“今又生”為例，該藥以抗癌基因p53為靶點，在腫瘤細胞中引入外源p53蛋白以達成抗癌作用。但現在已有很多文獻報道，p53基因在一半以上的癌癥中失活，或者由于突變以及顯性抑制作用，其抗癌作用失去甚至由抑癌基因變為癌基因。如果不事先對病人進行基因診斷和預測，對占一半以上的p53基因失活或對p53不敏感癌癥患者使用這類藥物，將很難實現其抗癌效果。因此，尋找p53替代抗癌通路中的分子靶點，是目前應用基因療法治療癌癥研究中的關鍵。第二，目前該類藥物的病毒載體缺乏較強的腫瘤靶向作用，使得藥物難于在靶部形成聚集，欲提高藥物局部濃度需加大用藥劑量，容易引起機體免疫反應造成不良后果；第三，由于其載體是非復制型病毒載體，在感染腫瘤細胞后外源抗癌基因表達時間相對較短，往往在抗癌蛋白表達尚未形成有效的抗癌濃度之前已經被機體所清除，導致基因治療效果不佳。?

發明人在尋找腫瘤治療的新靶點過程中，通過分析肝癌臨床樣本發現驅動蛋白家族中的一個成員——分裂期磷蛋白1（M-phase?phosphoprotein?1，MPHOSPH1）基因，在絕大多數肝癌組織中相比癌旁組織及非肝癌組織顯著高表達。該結果以前未見國內外文獻報道。基于RNA干擾（RNAi）技術，發明人構建了表達MPHOSPH1的小發夾RNA（small?hairpin?RNA，shRNA）的重組腺病毒載體（以下簡稱為Ad-shMPP1，如圖1所示），該重組腺病毒能在小鼠體內下調肝癌細胞內源MPHOSPH1的表達，顯著阻滯細胞有絲分裂，并同時誘導多倍體細胞的形成，最終誘導肝癌細胞發生衰老及有絲分裂后凋亡，與傳統p53信號通路相比具有不同的抗癌機制。動物體內結果顯示，靜脈注射該重組腺病毒，不僅能顯著抑制小鼠原位肝癌的發生，恢復動物由于肝癌所導致的肝損傷，且能顯著提升肝癌對于化療藥物紫杉醇的敏感性，產生協同抗癌作用，顯示了良好的臨床應用價值。

發明內容

本發明所要解決的的第一個問題在于提供一種全新的肝癌藥物靶標——分裂期磷蛋白1，其彌補傳統基因治療藥物靶標p53基因的廣譜性；本發明所要解決的第二個問題是提供了一種表達針對分裂期磷蛋白1的小發夾RNA的重組溶瘤腺病毒及其制備方法；本發明所要解決的第三個問題，是提供了該重組溶瘤腺病毒在制備癌癥治療藥物中的應用。

???????本發明提供了一種攜帶靶向人源的驅動蛋白分裂期磷蛋白1的小發夾RNA的重組溶瘤腺病毒Ad-shMPP1的構建方法，與野生型腺病毒相比，該重組溶瘤腺病毒由腫瘤特異性啟動子——存活素啟動子替換病毒復制必需基因E1A的啟動子，刪除復制非必需基因E1B55KD，并插入分裂期磷蛋白1的小發夾RNA的表達框（如圖1所示），其具體方案如下：

步驟一，?質粒pSP-Δ55/?shMPP1的構建?

1）?用XbaI和BamHI限制性內切酶，雙酶切消化pXC2質粒，回收1170?kp片段并克隆到經同樣雙酶切的pZD55載體中，構建成質粒pXC2-Δ55；

2）?以HEK293細胞基因組DNA為模板，引物如下：?

正向:?5’-ATG?AAT?TCC?GCG?TTC?TTT?GAA?AGC?AG-3’?（SEQ?ID?No?1），

反向:?5’-AAT?CTC?GAG?TGC?CGC?CGC?CGC?CAC?CT-3’?（SEQ?ID?No?2），