[發明專利]一種攜帶靶向分裂期磷蛋白1基因的小發夾RNA的重組溶瘤腺病毒

在審

• 申請號: 201410470155.1
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104195117A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 黃昆;劉欣然;鄭凌;吳瓊
• 申請（專利權）人: 武漢百奧京生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/861;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

1.MPHOSPH1在作為肝癌基因治療藥物靶標上的應用。

2.一種攜帶靶向分裂期磷蛋白1基因的小發夾RNA的重組溶瘤腺病毒的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，?質粒pSP-Δ55/?shMPP1的構建?

用XbaI和BamHI限制性內切酶，雙酶切消化pXC2質粒，回收1170?kp片段并克隆到經同樣雙酶切的pZD55載體中，構建成質粒pXC2-Δ55；

以HEK293細胞基因組DNA為模板，引物如下：?

正向:?5’-ATG?AAT?TCC?GCG?TTC?TTT?GAA?AGC?AG-3’?，

反向:?5’-AAT?CTC?GAG?TGC?CGC?CGC?CGC?CAC?CT-3’，

經PCR擴增，得到含人269?bp?存活素基因的啟動子部分片段，并克隆到pTG19-T載體上，構成質粒pTG19-SP；

3）pTG19-SP經XhoI?and?SalI雙酶切，回收280?bp片段并克隆到pXC2-Δ55的SalI限制性位點，經過鑒定存活素基因啟動子的方向，得到質粒pSP-Δ55；?

4）合成如下兩條寡聚核苷酸：

正向:?5’-GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTC?TTCACCTTTTTG-3’，

反向:?5’-AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTC?GGTCGCACT?TCTTCAC-3’，

分別退火，克隆到經ApaI/EcoRI雙酶切的pBS/U6載體上，其中ApaI經T4?DNA聚合酶處理成平端，得到質粒pBS/U6-shMPP1；

5）pBS/U6-shMPP1經BamHI消化，回收400?bp包含U6/shMPP1表達框的片段并克隆到pSP-Δ55的BglII位點上得到質粒pSP-shMPP1-Δ55；

步驟二，同源重組法構建重組溶瘤腺病毒?

6孔板每孔鋪入4.0?×10⁵?人胚腎細胞系——HEK293細胞，共轉染穿梭質粒pSP-shMPP1-Δ55與大質粒pBHGE3，二周之后觀察細胞狀態直至產生空斑；?

步驟三，病毒收集純化

從空斑中挑選病毒單克隆，鑒定后大規模復制病毒，收集細胞培養物，經氯化銫密度梯度離心純化病毒。

3.????權利要求2所構建的重組溶瘤腺病毒在制備治療肝癌藥物中的應用。