[發明專利]一種睪丸間質干細胞的分離、培養方法及其用途

有效

• 申請號: 201410469363.X
• 申請日: 2014-09-15
• 公開（公告）號: CN104212763B
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 項鵬;姜美花;蔡炳;臧志軍;汪建成
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/52;A61P5/26
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司44259
• 代理人: 姚迎新

技術領域

本發明涉及干細胞與組織工程技術領域，尤其涉及一種睪丸間質干細胞的分離、培養方法及其用途。

背景技術

隨著全球老齡化進展加速，各種衰老相關性疾病日益引起人們的重視。其中由于原發性或繼發性睪丸間質細胞功能障礙引起的遲發性性腺功能減退(LOH)、老年雄激素缺乏癥等疾病在50歲以上男性的發病率高達20％以上，它不僅影響生活質量，也易導致心血管疾病、精神疾病等重大疾病的發生。睪酮補充治療是目前主要治療手段。據估計，1997年美國的睪酮產品市場規模約為0.49億美元，而在2002年就超過3億美元。統計數字表明，45歲以上的男性有20％受到低睪酮水平的困擾，而接受治療的僅2％，表明存在巨大的市場潛力。但是外源性睪酮制劑無法模擬機體睪酮的生理情況，長期給予會導致睪丸局部睪酮濃度下降，最終引起精液質量下降并進而影響男性生育功能，因此，睪酮制劑治療LOH治療始終有很多爭議。

睪丸間質細胞移植是治療遲發性性腺功能減退癥等疾病的最佳手段。鄧春華研究團隊成功體外培養出睪丸間質細胞后，對血清睪酮和游離睪酮水平均明顯下降的老年SD大鼠進行了睪丸間質細胞移植，在沒有應用免疫抑制劑的情況下，移植后老年SD大鼠的血清睪酮和游離睪酮均顯著升高至成年SD大鼠的水平，提示同種異體睪丸間質細胞移植是一種新的、有效的、更符合生理的補充睪酮的方法。但睪丸間質細胞的來源有限，擴增能力有限，大大限制了其進一步的應用。

睪丸間質干細胞是具有自我更新、可分化為睪丸間質細胞的一類細胞。在大鼠出生后7天，梭形的睪丸間質干細胞主要分布在大鼠睪丸間質細胞部分以及血管周圍。Davidoff等認為睪丸的血管即血管平滑肌細胞及周細胞是睪丸間質細胞的前體細胞(Davidoff MS,Middendorff R,Enikolopov G,Riethmacher D,Holstein AF,Muller D.Progenitor cells of the testosterone-producing Leydig cells revealed.The Journal of cell biology 2004；167:935-944.)。目前對睪丸間質干細胞的研究甚少，沒有明確的特意標志物。而對于睪丸間質干細胞的純化方法也僅僅局限于Metrizamide或Percoll密度梯度離心法，結合PDGFR-α陽性且LHR陰性細胞的免疫選擇(Immunoselection)法，純化出大鼠睪丸中的睪丸間質干細胞。葛仁山等人取60只7天齡大鼠睪丸進行睪丸間質干細胞分離，最終獲得每一個睪丸中8，500睪丸間質干細胞，將分離得到的睪丸間質干細胞移植入睪丸間質細胞損傷大鼠模型中(用全稱，二甲磺酸乙烷，EDS)，發現睪丸間質干細胞可以在體內定植，并分化成有功能的睪丸間質細胞(Ge RS,Dong Q,Sottas CM,Papadopoulos V,Zirkin BR,Hardy MP.In search of rat stem Leydig cells:identification,isolation,and lineage-specific development.Proc Natl Acad Sci U S A.2006；103:2719-2724)。雖然，移植睪丸間質干細胞治療LOH為臨床提供了良好的應用前景，但是現行方法存在獲得細胞量少，細胞種類不明確，缺乏細胞鑒定標準等眾多弊端，明顯制約了臨床應用，需要進一步的深入研究。

CD51又稱為整合素蛋白αv，是整合素蛋白超家族中的一員，其實質為異質二聚體整合膜蛋白由α鏈和β鏈兩部分構成。進一步可細分為αvβ1，αvβ3，αvβ5，αvβ6和αvβ8共5個亞型。在調控胚胎器官形成，血管生成，血管通透性，癌癥演進，上皮組織的炎癥及纖維化中發揮重要作用要作用。有研究報道，CD51廣泛分布于牙周韌帶，人臍帶血及華通氏膠中MSC樣細胞的表面。同時，也發現CD51存在于大部分人骨髓MSC細胞的表面，認為是MSC的標志物(Pinho S,Lacombe J,Hanoun M et al.PDGFRalpha and CD51mark human nestin+sphere-forming mesenchymal stem cells capable of hematopoietic progenitor cell expansion.The Journal of experimental medicine 2013；210:1351-1367)。目前尚未見研究報道以CD51為標記物分離和鑒定睪丸間質干細胞的相關研究。

發明內容