[發明專利]一種睪丸間質干細胞的分離、培養方法及其用途

有效

• 申請號: 201410469363.X
• 申請日: 2014-09-15
• 公開（公告）號: CN104212763B
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 項鵬;姜美花;蔡炳;臧志軍;汪建成
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/52;A61P5/26
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司44259
• 代理人: 姚迎新

1.一種睪丸間質干細胞的分離方法，其特征在于：所述的分離方法是選擇7天或2個月齡小鼠，分離小鼠睪丸，用膠原酶IV消化睪丸組織，過濾消化后的細胞懸液，濾過篩網，獲得單個細胞，所述細胞用CD51抗體進行標記；

以IgG標記的對照樣本細胞為陰性對照細胞，將用CD51抗體進行標記的單個細胞通過流式細胞儀進行分選，收集CD51熒光強度是陰性對照細胞的熒光強度的10倍或以上的細胞，從而分離出CD51陽性的睪丸間質干細胞。

2.如權利要求1所述的睪丸間質干細胞的分離方法，其特征在于：所述的分離方法的具體步驟如下：

(1)利用生后7天或兩月齡雄性小鼠，采用頸椎脫臼法處死，在無菌條件下打開陰囊部，取出雙側睪丸并在解剖顯微鏡下去除被膜和血管，用含1％雙抗的1×PBS反復沖洗，隨后用吸管及槍頭輕輕吹打，使間質組織與曲精細管分散開，并用小剪刀剪碎組織部分，隨后放入1mg/ml的IV型膠原酶溶液，于37℃、5％CO₂條件下孵育15min，加入含0.5％BSA的1×PBS終止膠原酶的消化，1500rmp離心5min；棄去上清液，用孔徑為40μm的尼龍網過濾懸液，去除未消化的曲細精管，收集單細胞，以1500rmp離心5min，得到睪丸細胞懸液；

(2)進行CD51抗體標記，CD51抗體與睪丸細胞懸液混合，兩者體積比為1:100，4℃微旋孵育30分鐘，對照細胞樣本與IgG進行孵育，棄清液，PBS緩沖液洗滌2次，經流式分選收集表達CD51的抗體熒光強度是陰性對照細胞的熒光強度的10倍或以上的細胞，從而分離出所述CD51陽性睪丸間質干細胞。